На Алцхајмеровата болест (АД) и недостасуваат протеински биомаркери кои ја рефлектираат нејзината повеќекратна основна патофизиологија, што го попречува напредокот на дијагнозата и третманот. Овде, ние користиме сеопфатна протеомика за да ги идентификуваме биомаркерите на цереброспиналната течност (CSF) кои претставуваат широк опсег на патофизиологија на АД. Мултиплексната масена спектрометрија идентификуваше приближно 3.500 и приближно 12.000 протеини во AD CSF и мозокот, соодветно. Мрежната анализа на мозочниот протеом реши 44 модули за биолошка разновидност, од кои 15 се преклопуваа со протеомот на цереброспиналната течност. Маркерите на CSF AD во овие преклопувачки модули се преклопени во пет протеински групи, што претставуваат различни патофизиолошки процеси. Синапсите и метаболитите во мозокот на АД се намалуваат, но CSF се зголемува, додека миелинацијата богата со глијали и имуните групи во мозокот и цереброспиналната течност се зголемуваат. Конзистентноста и специфичноста на болеста на промените на панелот беа потврдени во повеќе од 500 дополнителни примероци на CSF. Овие групи, исто така, идентификуваа биолошки подгрупи во асимптоматска АД. Генерално, овие резултати се ветувачки чекор кон алатките за биомаркери базирани на веб за клинички апликации во АД.
Алцхајмеровата болест (АД) е најчеста причина за невродегенеративна деменција ширум светот и се карактеризира со широк спектар на дисфункции на биолошкиот систем, вклучувајќи синаптички пренос, имунитет посредуван од глијали и митохондријален метаболизам (1-3). Сепак, неговите воспоставени протеински биомаркери сè уште се фокусираат на откривање на амилоид и тау протеин, и затоа не можат да ја одразат оваа разновидна патофизиологија. Овие „јадрени“ протеински биомаркери кои најсигурно се мерат во цереброспиналната течност (CSF) вклучуваат (i) амилоид бета пептид 1-42 (Aβ1-42), кој го рефлектира формирањето на кортикални амилоидни плаки; (ii) тотален тау, знак за дегенерација на аксонот; (iii) фосфо-тау (p-tau), претставник на патолошка тау хиперфосфорилација (4-7). Иако овие биомаркери на цереброспиналната течност во голема мера го олеснија нашето откривање на „означени“ протеински болести на АД (4-7), тие претставуваат само мал дел од сложената биологија зад болеста.
Недостатокот на патофизиолошка разновидност на биомаркерите на АД доведе до многу предизвици, вклучувајќи (i) неможност да се идентификува и квантифицира биолошката хетерогеност на пациентите со АД, (ii) недоволно мерење на тежината и прогресијата на болеста, особено во претклиничката фаза, и iii) развој на терапевтски лекови кои не успеаја целосно да ги решат сите аспекти на невролошкото влошување. Нашето потпирање на значајна патологија за опишување на АД од сродни болести само ги влошува овие проблеми. Сè повеќе докази покажуваат дека повеќето постари луѓе со деменција имаат повеќе од една патолошка карактеристика на когнитивното опаѓање (8). Дури 90% или повеќе од лицата со патологија на АД исто така имаат васкуларна болест, инклузии на TDP-43 или други дегенеративни болести (9). Овие високи пропорции на патолошко преклопување ја нарушија нашата сегашна дијагностичка рамка за деменција и потребна е посеопфатна патофизиолошка дефиниција на болеста.
Со оглед на итната потреба за разновидни биомаркери на АД, полето сè повеќе го усвојува методот „омикс“ заснован на целокупниот систем за откривање биомаркери. Алијансата за забрзано фармацевтско партнерство (AMP)-AD беше лансирана во 2014 година и е во првите редови на програмата. Овој мултидисциплинарен напор на Националниот институт за здравство, академијата и индустријата има за цел да користи системски стратегии за подобро да ја дефинира патофизиологијата на АД и да развие дијагностичка анализа и стратегии за третман на биолошката разновидност (10). Како дел од овој проект, мрежната протеомика стана ветувачка алатка за унапредување на системски биомаркери во АД. Овој непристрасен пристап управуван од податоци организира комплексни сетови на протеомски податоци во групи или „модули“ на ко-изразени протеини кои се поврзани со специфични типови на клетки, органели и биолошки функции (11-13). Спроведени се речиси 12 мрежни протеомични студии богати со информации на мозокот на АД (13-23). Генерално, овие анализи покажуваат дека протеомот на мозочната мрежа АД одржува високо зачувана модуларна организација во независни групи и повеќе кортикални региони. Дополнително, некои од овие модули покажуваат репродуктивни промени во изобилството поврзано со АД низ сетови на податоци, што ја одразува патофизиологијата на повеќе болести. Колективно, овие наоди демонстрираат ветувачка точка за прицврстување за откривањето на протеомот на мозочната мрежа како системски биомаркер во АД.
Со цел да се трансформира протеомот на мозочната мрежа на АД во клинички корисни системски биомаркери, ја комбиниравме мрежата добиена од мозокот со протеомската анализа на АД ЦСФ. Овој интегриран пристап доведе до идентификација на пет ветувачки групи на биомаркери на цереброспиналната течност кои се поврзани со широк опсег на патофизиологија базирана на мозокот, вклучувајќи синапси, крвни садови, миелинизација, воспаление и дисфункција на метаболичките патишта. Успешно ги потврдивме овие биомаркерски панели преку повеќекратни анализи за репликација, вклучувајќи повеќе од 500 примероци на цереброспинална течност од различни невродегенеративни болести. Овие анализи за валидација вклучуваат испитување на групни цели во цереброспиналната течност на пациенти со асимптоматска АД (AsymAD) или покажување докази за абнормална акумулација на амилоид во нормална когнитивна средина. Овие анализи ја истакнуваат значајната биолошка хетерогеност кај популацијата AsymAD и идентификуваат панел-маркери кои можат да подтипираат поединци во најраните фази на болеста. Генерално, овие резултати претставуваат клучен чекор во развојот на алатки за протеински биомаркери базирани на повеќе системи кои можат успешно да решат многу од клиничките предизвици со кои се соочува АД.
Главната цел на оваа студија е да се идентификуваат нови биомаркери на цереброспиналната течност кои рефлектираат различни патофизиологија базирана на мозокот што доведува до АД. Сликата S1 ја прикажува нашата методологија на истражување, која вклучува (i) сеопфатна анализа водена од прелиминарните наоди на AD CSF и мрежниот мозочен протеом за да се идентификуваат повеќе биомаркери за болеста CSF поврзани со мозокот, и (ii) последователна репликација Овие биомаркери се во неколку независни цереброспинални флуидни групи. Истражувањето ориентирано кон откривање започна со анализа на диференцијалната експресија на CSF кај 20 когнитивно нормални индивидуи и 20 пациенти со АД во Истражувачкиот центар за Алцхајмерова болест Емори Гоизуета (ADRC). Дијагнозата на АД е дефинирана како значајно когнитивно оштетување во присуство на низок Aβ1-42 и покачени нивоа на вкупниот тау и p-tau во цереброспиналната течност [Средна когнитивна оцена на Монтреал (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Табела S1A). Контролата (просечно МСУ, 26,7 ± 2,2) имаше нормални нивоа на биомаркери на CSF.
Човечкиот CSF се карактеризира со динамичен опсег на изобилство на протеини, во кој албумин и други екстремно изобилни протеини можат да спречат откривање на протеини од интерес (24). За да ја зголемиме длабочината на откривањето на протеините, ги отстранивме првите 14 високо изобилни протеини од секој примерок од CSF пред анализата со масена спектрометрија (MS) (24). Вкупно 39.805 пептиди беа идентификувани од MS, кои беа мапирани на 3691 протеом во 40 примероци. Квантификацијата на протеините се врши со означување на повеќекратна тандем маса (TMT) (18, 25). За да ги решиме податоците што недостасуваат, ги вклучивме само оние протеини кои беа квантифицирани во најмалку 50% од примероците во последователната анализа, со што конечно се квантифицираа 2875 протеоми. Поради значајната разлика во нивоата на вкупното изобилство на протеини, контролниот примерок статистички се сметаше за надворешно (13) и не беше вклучен во последователната анализа. Вредностите на изобилството на преостанатите 39 примероци беа приспособени според возраста, полот и сериската коваријанса (13-15, 17, 18, 20, 26).
Користејќи статистичка t-тест анализа за да се оцени диференцијалната експресија на збирот на податоци за регресија, оваа анализа идентификуваше протеини чии нивоа на изобилство беа значително променети (P <0,05) помеѓу контролните и АД случаите (Табела S2A). Како што е прикажано на слика 1А, изобилството на вкупно 225 протеини во АД беше значително намалено, а изобилството од 303 протеини беше значително зголемено. Овие диференцијално изразени протеини вклучуваат неколку претходно идентификувани АД маркери на цереброспиналната течност, како протеин тау поврзан со микротубули (MAPT; P = 3,52 × 10-8), неврофиламент (NEFL; P = 6,56 × 10-3), протеин поврзан со растот 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Протеин за врзување масни киселини 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), хитиназа 3 како 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Неврален гранулин (NRGN; P = 3,43 × 10-4) и VGF фактор на раст на нервите (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Сепак, идентификувавме и други многу важни цели, како што е инхибиторот на дисоцијација на БДП 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) и модуларното врзување на калциумот поврзано со SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9) . Анализата на генската онтологија (GO) на 225 значително намалени протеини откри блиски врски со процесите на телесните течности како што се стероидниот метаболизам, коагулацијата на крвта и активноста на хормоните (Слика 1Б и Табела S2B). Спротивно на тоа, значително зголемениот протеин од 303 е тесно поврзан со клеточната структура и енергетскиот метаболизам.
(А) Границата на вулканот ја покажува промената на log2 пати (x-оската) во однос на -log10 статистичката P вредност (y-оска) добиена со t-тестот, кој се користи за откривање на диференцијална експресија помеѓу контролната (CT) и контролата (CT) и АД случаи на CSF протеом од сите протеини. Протеините со значително намалени нивоа (P <0,05) во АД се прикажани со сина боја, додека протеините со значително зголемени нивоа кај болеста се прикажани со црвено. Избраниот протеин е означен. (Б) Врвните GO термини поврзани со протеинот се значително намалени (сини) и зголемени (црвено) во АД. Ги прикажува трите GO термини со највисоки z-оценки во полето на биолошките процеси, молекуларните функции и клеточните компоненти. (C) MS го измери нивото на MAPT во примерокот на цереброспиналната течност (лево) и неговата корелација со нивото на тау ELISA на примерокот (десно). Се прикажува коефициентот на корелација на Пирсон со релевантната вредност P. Поради недостаток на податоци ELISA за еден случај на АД, овие бројки вклучуваат вредности за 38 од 39 анализирани случаи. (Г) Надгледувана кластерска анализа (P <0,0001, Бенџамини-Хохберг (BH) прилагоден P <0,01) на контролната и AD CSF пронајдени примероци користејќи 65 најзначајно променети протеини во множеството податоци. Стандардизирај, нормализирај.
Протеомското ниво на MAPT е тесно поврзано со независно измереното ниво на ELISA tau (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Слика 1C), што ја поддржува валидноста на нашето мерење на MS. По дигестијата на трипсин на ниво на амилоид прекурсорски протеин (APP), изоформните специфични пептиди мапирани на C-крајот на Aβ1-40 и Aβ1-42 не можат ефикасно да се јонизираат (27, 28). Затоа, APP пептидите што ги идентификувавме немаат никаква врска со нивоата на ELISA Aβ1-42. Со цел да се оцени диференцијалното изразување на секој случај, користевме диференцијално изразени протеини со P <0,0001 [стапка на лажно откривање (FDR) корегирана P <0,01] за да извршиме надгледувана кластерска анализа на примероците (Табела S2A). Како што е прикажано на Слика 1Д, овие 65 високо значајни протеини можат правилно да ги групираат примероците според состојбата на болеста, освен еден случај на АД со контролни карактеристики. Од овие 65 протеини, 63 се зголемиле во АД, додека само два (CD74 и ISLR) се намалиле. Севкупно, овие анализи на цереброспиналната течност идентификуваа стотици протеини во АД кои можат да послужат како биомаркери на болеста.
Потоа извршивме независна мрежна анализа на мозочниот протеом на АД. Мозочната група на ова откритие вклучуваше дорзолатерален префронтален кортекс (DLPFC) од контролни (n = 10), Паркинсонова болест (PD; n = 10), мешани AD/PD (n = 10) и AD (n = 10) случаи. ) Примерок. Емери Гоизуета АДРЦ. Демографијата на овие 40 случаи е претходно опишана (25) и е сумирана во Табела S1B. Користивме TMT-MS за да ги анализираме овие 40 мозочни ткива и групата на репликација од 27 случаи. Севкупно, овие две групи на податоци за мозокот произведоа 227.121 уникатни пептиди, кои беа мапирани на 12.943 протеоми (25). Само оние протеини кои беа квантифицирани во најмалку 50% од случаите беа вклучени во следните испитувања. Конечниот сет на податоци за откритието содржи 8817 квантифицирани протеини. Прилагодете ги нивоата на изобилство на протеини врз основа на возраста, полот и пост-морталниот интервал (PMI). Анализата на диференцијалната експресија на збирот на податоци по регресија покажа дека >2000 нивоа на протеини беа значително променети [P <0,05, анализа на варијанса (ANOVA)] во две или повеќе групи на болести. Потоа, извршивме надгледувана кластерска анализа врз основа на диференцијално изразените протеини и P <0,0001 во AD/контрола и/или AD/PD споредби (слика S2, A и B, Табела S2C). Овие 165 високо изменети протеини јасно ги прикажуваат случаите со АД патологија од контролните и PD примероците, потврдувајќи ги силните промени специфични за АД во целиот протеом.
Потоа користевме алгоритам наречен Мрежна анализа на ко-изразување на пондерираните гени (WGCNA) за да извршиме мрежна анализа на откриениот мозочен протеом, кој го организира збирот на податоци во протеински модули со слични шеми на изразување (11-13). Анализата идентификуваше 44 модули (M) ко-експресирани протеини, подредени и нумерирани од најголемите (M1, n = 1821 протеини) до најмалите (M44, n = 34 протеини) (Слика 2А и Табела S2D) ). Како што споменавме погоре (13) Пресметајте го репрезентативниот израз на профилот или карактеристичниот протеин на секој модул и поврзете го со состојбата на болеста и патологијата на АД, односно воспоставете ја алијансата на Регистарот на Алцхајмерова болест (CERAD) и Braak Score (Слика 2Б). Севкупно, 17 модули беа значително поврзани со АД невропатологијата (P <0,05). Многу од овие модули поврзани со болеста се исто така богати со маркери специфични за клеточниот тип (Слика 2Б). Како што беше споменато погоре (13), збогатувањето на клеточниот тип се одредува со анализа на преклопувањето на модулите и референтната листа на гени специфични за клеточниот тип. Овие гени се добиени од објавени податоци во изолирани неврони на глувци, ендотелијални и глијални клетки. Експеримент за секвенционирање на РНК (РНК-сек) (29).
(А) Откријте ја WGCNA на мозочниот протеом. (Б) Битежинска средна корелација (BiCor) анализа на модуларниот потписен протеин (првата главна компонента на модуларната протеинска експресија) со невропатолошки карактеристики на АД (горе), вклучувајќи ги резултатите CERAD (Aβ плакета) и Braak (tau tangles). Интензитетот на позитивни (црвени) и негативни (сини) корелации се прикажани со топлинска карта во две бои, а ѕвездичките укажуваат на статистичка значајност (P <0,05). Користете Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (долу) за да ја процените поврзаноста на типот на клетките на секој протеински модул. Интензитетот на црвеното засенчување го покажува степенот на збогатување на типот на клетките, а ѕвездичката покажува статистичка значајност (P <0,05). Користете го методот BH за да ја поправите вредноста P добиена од FET. (В) GO анализа на модуларни протеини. Најтесно поврзаните биолошки процеси се прикажани за секој модул или поврзана група модули. олиго, олигодендроцит.
Збир од пет тесно поврзани модули богати со астроцити и микроглија (M30, M29, M18, M24 и M5) покажаа силна позитивна корелација со АД невропатологијата (Слика 2Б). Онтолошката анализа ги поврзува овие глијални модули со клеточниот раст, пролиферацијата и имунитетот (Слика 2C и Табела S2E). Два дополнителни глијални модули, М8 и М22, исто така се силно регулирани кај болеста. М8 е многу поврзан со рецепторската патека слична на Toll, сигнална каскада која игра клучна улога во вродениот имунолошки одговор (30). Во исто време, M22 е тесно поврзан со пост-преведувачката модификација. М2, кој е богат со олигодендроцити, покажува силна позитивна корелација со патологијата на АД и онтолошка врска со синтезата на нуклеозид и репликацијата на ДНК, што укажува на зголемена клеточна пролиферација кај болестите. Генерално, овие наоди го поддржуваат издигнувањето на глијалните модули што претходно ги забележавме во протеомот на мрежата АД (13, 17). Во моментов е откриено дека многу глијални модули поврзани со АД во мрежата покажуваат пониски нивоа на изразување во случаите на контрола и ПД, што ја истакнува нивната специфичност на болеста која е покачена во АД (Слика S2C).
Само четири модули во нашата мрежна протеом (M1, M3, M10 и M32) се силно негативно корелирани со AD патологијата (P <0,05) (Слика 2, B и C). И М1 и М3 се богати со невронски маркери. М1 е многу поврзан со синаптичките сигнали, додека М3 е тесно поврзан со митохондријалната функција. Нема докази за збогатување на типот на клетки за М10 и М32. М32 ја рефлектира врската помеѓу М3 и клеточниот метаболизам, додека М10 е многу поврзан со растот на клетките и функцијата на микротубулите. Во споредба со АД, сите четири модули се зголемени во контролата и ПД, што им дава промени на АД специфични за болеста (Слика S2C). Генерално, овие резултати го поддржуваат намаленото изобилство на модули богати со неврони што претходно ги забележавме во АД (13, 17). Накратко, мрежната анализа на протеомот на мозокот што ја откривме произведе специјално изменети модули за АД во согласност со нашите претходни наоди.
АД се карактеризира со рана асимптоматска фаза (AsymAD), во која поединците покажуваат акумулација на амилоид без клинички когнитивен пад (5, 31). Оваа асимптоматска фаза претставува критичен прозорец за рано откривање и интервенција. Претходно демонстриравме силно модуларно зачувување на протеомот на мозочната мрежа AsymAD и AD преку независни сетови на податоци (13, 17). Со цел да се осигураме дека мозочната мрежа што моментално ја откривме е конзистентна со овие претходни наоди, го анализиравме зачувувањето на 44 модули во реплицираниот сет на податоци од 27 организации на DLPFC. Овие организации вклучуваат контролни (n = 10), AsymAD (n = 8 ) и AD (n = 9) случаи. Контролните и АД примероците беа вклучени во анализата на нашата мозочна група за откривање (Табела S1B), додека случаите на AsymAD беа единствени само во групата на репликација. Овие случаи на AsymAD, исто така, дојдоа од банката за мозок Emory Goizueta ADRC. Иако когницијата беше нормална во моментот на смртта, нивоата на амилоид беа ненормално високи (просечно CERAD, 2,8 ± 0,5) (Табела S1B).
TMT-MS анализата на овие 27 мозочни ткива резултираше со квантификација на 11.244 протеоми. Овој конечен број ги вклучува само оние протеини квантифицирани во најмалку 50% од примероците. Овој реплициран сет на податоци содржи 8638 (98,0%) од 8817 протеини откриени во нашата анализа на мозокот и има речиси 3000 значително променети протеини помеѓу контролната и AD групацијата (P <0,05, по Tukey-овиот парен t тест за анализа на варијанса) ( Табела S2F). Меѓу овие диференцијално изразени протеини, 910, исто така, покажаа значајни промени во нивото помеѓу случаите на АД и контролните случаи на мозочен протеом (P <0,05, по ANOVA Tukey парен т-тест). Вреди да се напомене дека овие 910 маркери се многу конзистентни во насоката на промена помеѓу протеомите (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Слика S3A). Помеѓу зголемените протеини, протеините со најконзистентни промени помеѓу збирките на податоци се главно членови на модулите M5 и M18 богати со глијали (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 и GFAP). Меѓу намалените протеини, оние со најконзистентни промени беа речиси исклучиво членови на М1 модулот (NPTX2, VGF и RPH3A) поврзани со синапсата. Понатаму ги потврдивме промените поврзани со АД на средниот кин (MDK), CD44, секретираниот протеин поврзан со frizzled 1 (SFRP1) и VGF со вестерн blotting (слика S3B). Анализата за зачувување на модулите покажа дека околу 80% од протеинските модули (34/44) во мозочниот протеом биле значително зачувани во множеството податоци за репликација (z-резултат> 1,96, FDR коригиран P <0,05) (Слика S3C). Четиринаесет од овие модули беа специјално резервирани помеѓу двата протеома (z-оценка> 10, FDR коригиран P <1,0 × 10-23). Генерално, откривањето и репликацијата на високиот степен на конзистентност во диференцијалната експресија и модуларниот состав помеѓу протеомот на мозокот ја нагласува репродуктивноста на промените во протеините на фронталниот кортекс на АД. Покрај тоа, исто така потврди дека AsymAD и понапредните болести имаат многу слична структура на мозочната мрежа.
Подетална анализа на диференцијалната експресија во множеството податоци за репликација на мозокот го нагласува значителниот степен на промени во протеинот AsymAD, вклучувајќи вкупно 151 значително променети протеини помеѓу AsymAD и контролата (P <0,05) (Слика S3D). Во согласност со оптоварувањето на амилоидот, APP во мозокот на AsymAD и AD значително се зголеми. MAPT значително се менува само во АД, што е во согласност со зголемените нивоа на заплеткувања и неговата позната корелација со когнитивниот пад (5, 7). Модулите богати со глијали (M5 и M18) се многу рефлектирани во зголемените протеини во AsymAD, додека модулот M1 поврзан со невронот е најрепрезентативен од намалените протеини во AsymAD. Многу од овие маркери AsymAD покажуваат поголеми промени во симптоматските болести. Меѓу овие маркери е SMOC1, глијален протеин кој припаѓа на М18, кој е поврзан со тумори на мозокот и развој на очите и екстремитетите (32). MDK е фактор на раст кој го врзува хепаринот поврзан со клеточниот раст и ангиогенезата (33), друг член на М18. Во споредба со контролната група, AsymAD значително се зголеми, проследено со поголемо зголемување на AD. Спротивно на тоа, синаптичкиот протеин неуропентраксин 2 (NPTX2) беше значително намален во мозокот на AsymAD. NPTX2 претходно беше поврзан со невродегенерација и има препознаена улога во посредувањето на возбудливите синапси (34). Генерално, овие резултати откриваат различни претклинички промени на протеините во АД кои се чини дека напредуваат со тежината на болеста.
Со оглед на тоа што постигнавме значителна длабочина на покриеност со протеини при откривањето на мозочниот протеом, се обидуваме поцелосно да го разбереме неговото преклопување со транскриптомот на АД на ниво на мрежа. Затоа, го споредивме мозочниот протеом што го откривме со модулот што претходно го генериравме од мерењето на микросреди на 18.204 гени во AD (n = 308) и контролните (n = 157) DLPFC ткива (13). преклопување. Севкупно, идентификувавме 20 различни РНК модули, од кои многу демонстрираа збогатување на специфични типови на клетки, вклучувајќи неврони, олигодендроцити, астроцити и микроглија (Слика 3А). Повеќекратните промени на овие модули во АД се прикажани на Слика 3Б. Во согласност со нашата претходна анализа на преклопување на протеин-РНК користејќи го подлабокиот неозначен MS протеом (околу 3000 протеини) (13), повеќето од 44-те модули во мрежата на протеомот на мозокот што ги најдовме се во мрежата на транскриптом. Нема значајно преклопување. Дури и во нашето откритие и репликација на 34 протеински модули кои се многу задржани во мозочниот протеом, само 14 (~ 40%) го поминаа Фишеровиот точен тест (FET) се покажа дека има статистички значајно преклопување со транскриптомот (Слика 3А). Компатибилен со поправка на оштетување на ДНК (P-M25 и P-M19), транслација на протеини (P-M7 и P-M20), врзување/спојување на РНК (P-M16 и P-M21) и таргетирање на протеини (P-M13 и P- M23) не се преклопува со модулите во транскриптомот. Затоа, иако се користи подлабок сет на податоци за протеом во тековната анализа на преклопување (13), најголемиот дел од мрежниот протеом на АД не е мапиран во мрежата на транскриптом.
(А) Хипергеометрискиот FET го демонстрира збогатувањето на маркерите специфични за типот на клетките во РНК-модулот на транскриптомот АД (горе) и степенот на преклопување помеѓу модулите РНК (оска x) и протеин (y-оска) на мозокот АД (долу) . Интензитетот на црвеното засенчување го означува степенот на збогатување на типовите ќелии во горниот панел и интензитетот на преклопување на модулите во долниот панел. Ѕвездичките укажуваат на статистичка значајност (P <0,05). (Б) Степенот на корелација помеѓу карактеристичните гени на секој транскриптомски модул и статусот на АД. Модулите од левата страна се најнегативно корелирани со АД (сина), а оние од десната страна се најпозитивна корелација со АД (црвена). Лог-трансформираната BH-корегирана P вредност го покажува степенот на статистичка значајност на секоја корелација. (В) Значајни преклопувачки модули со збогатување на заеднички тип на ќелија. (Г) Анализа на корелација на промената на log2 пати на означениот протеин (х-оска) и РНК (y-оска) во преклопувачкиот модул. Се прикажува коефициентот на корелација на Пирсон со релевантната вредност P. Микро, микроглија; небесни тела, астроцити. КТ, контрола.
Повеќето преклопувачки протеински и РНК модули споделуваат слични профили за збогатување на клеточниот тип и конзистентни насоки за промена на АД (Слика 3, Б и В). Со други зборови, модулот М1 поврзан со синапсите на мозочниот протеом (PM1) е мапиран на три хомологни РНК модули богати со неврони (R-M1, R-M9 и R-M16), кои се во АД. намалено ниво. Слично на тоа, протеинските модули М5 и М18 богати со глијали се преклопуваат со РНК модули богати со астроцити и микроглијални маркери (R-M3, R-M7 и R-M10) и се многу вклучени во зголемување на болестите. Овие споделени модуларни карактеристики помеѓу двете збирки податоци дополнително го поддржуваат збогатувањето на типот на клетките и промените поврзани со болеста што ги забележавме во мозочниот протеом. Сепак, забележавме многу значајни разлики помеѓу нивоата на РНК и протеини на поединечни маркери во овие заеднички модули. Анализата на корелација на диференцијалната експресија на протеомиката и транскриптомиката на молекулите во овие модули кои се преклопуваат (Слика 3Д) ја нагласува оваа недоследност. На пример, APP и неколку други протеини на глијални модули (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 и SFRP1) покажаа значително зголемување на протеомот на АД, но речиси и да немаше промена во транскриптомот на АД. Овие протеински специфични промени може да бидат тесно поврзани со амилоидните плаки (23, 35), истакнувајќи го протеомот како извор на патолошки промени и овие промени може да не се рефлектираат во транскриптомот.
По независна анализа на протеомите на мозокот и цереброспиналната течност што ги откривме, спроведовме сеопфатна анализа на двата множества на податоци за да ги идентификуваме биомаркерите на АД ЦСФ поврзани со патофизиологијата на мозочната мрежа. Прво мора да го дефинираме преклопувањето на двата протеома. Иако е општо прифатено дека CSF ги рефлектира неврохемиските промени во мозокот на АД (4), точниот степен на преклопување помеѓу мозокот на АД и протеомот на цереброспиналната течност е нејасен. Со споредување на бројот на заеднички генски производи откриени во нашите два протеома, откривме дека скоро 70% (n = 1936) од протеините идентификувани во цереброспиналната течност исто така беа квантифицирани во мозокот (Слика 4А). Повеќето од овие преклопувачки протеини (n = 1721) се мапирани на еден од 44-те модули за ко-изразување од множеството податоци на мозокот за откривање (Слика 4Б). Како што се очекуваше, шесте најголеми мозочни модули (M1 до M6) покажаа најголема количина на преклопување на CSF. Сепак, постојат помали модули на мозокот (на пример, M15 и M29) кои постигнуваат неочекувано висок степен на преклопување, поголем од мозочен модул двојно поголем од него. Ова нè мотивира да усвоиме подетален, статистички управуван метод за пресметување на преклопувањето помеѓу мозокот и цереброспиналната течност.
(А и Б) Протеините откриени во комплетите податоци за мозокот и цереброспиналната течност се преклопуваат. Повеќето од овие преклопувачки протеини се поврзани со еден од 44-те модули за ко-изразување на мрежата за ко-изразување на мозокот. (В) Откријте го преклопувањето помеѓу протеомот на цереброспиналната течност и протеомот на мозочната мрежа. Секој ред од топлинската карта претставува посебна анализа на преклопување на хипергеометрискиот FET. Горниот ред го прикажува преклопувањето (сиво/црно засенчување) помеѓу мозочниот модул и целиот протеом на CSF. Втората линија прикажува дека преклопувањето помеѓу мозочните модули и протеинот на цереброспиналната течност (засенчени во црвено) е значително регулирано во АД (P <0,05). Третиот ред покажува дека преклопувањето помеѓу мозочните модули и CSF протеинот (сино засенчување) е значително намалено регулирано во АД (P <0,05). Користете го методот BH за да ја поправите вредноста P добиена од FET. (Г) Панел со преклопен модул заснован на асоцијација на типот на ќелија и сродните термини GO. Овие панели содржат вкупно 271 протеин поврзани со мозокот, кои имаат значајна диференцијална експресија во протеомот на цереброспиналната течност.
Користејќи FET со една опашка, ја проценивме важноста на протеинското преклопување помеѓу протеомот на цереброспиналната течност и поединечните мозочни модули. Анализата откри дека вкупно 14 мозочни модули во множеството податоци на CSF имаат статистички значајни преклопувања (FDR прилагоден P <0,05) и дополнителен модул (M18) чие преклопување е блиску до значајно (FDR прилагодено P = 0,06) (Слика 4C , горниот ред). Ние сме заинтересирани и за модули кои силно се преклопуваат со диференцијално изразените CSF протеини. Затоа, применивме две дополнителни FET анализи за да одредиме кој од (i) CSF протеинот е значително зголемен во АД и (ii) CSF протеинот беше значително намален во АД (P <0,05, спарен t тест AD/контрола) Мозочни модули со значајно преклопување меѓу нив. Како што е прикажано во средниот и долниот ред на Слика 4C, овие дополнителни анализи покажуваат дека 8 од 44-те мозочни модули значително се преклопуваат со протеинот додаден во AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 и M38) . ), додека само два модула (M6 и M15) покажаа значајно преклопување со намалениот протеин во AD CSF. Како што се очекуваше, сите 10 модули се во 15-те модули со највисоко преклопување со протеомот на CSF. Затоа, претпоставуваме дека овие 15 модули се извори со висок принос на биомаркери на CSF добиени од АД од мозокот.
Ги преклопивме овие 15 модули кои се преклопуваат во пет големи протеински панели врз основа на нивната близина во дијаграмот на дрвото WGCNA и нивната поврзаност со типовите на клетки и генската онтологија (Слика 4Д). Првиот панел содржи модули богати со невронски маркери и протеини поврзани со синапсите (М1 и М12). Синаптичкиот панел содржи вкупно 94 протеини, а нивоата во протеомот на цереброспиналната течност значително се променија, што го прави најголемиот извор на маркери за цереброспинална течност поврзани со мозокот меѓу петте панели. Втората група (М6 и М15) покажа блиска врска со маркерите на ендотелијалните клетки и васкуларното тело, како што се „заздравувањето на раните“ (М6) и „регулацијата на хуморалниот имунолошки одговор“ (М15). М15 е исто така многу поврзан со метаболизмот на липопротеините, кој е тесно поврзан со ендотелот (36). Васкуларниот панел содржи 34 маркери за CSF поврзани со мозокот. Третата група вклучува модули (М2 и М4) кои се значително поврзани со маркерите на олигодендроцитите и клеточната пролиферација. На пример, термините за онтологија на највисоко ниво на М2 вклучуваат „позитивна регулација на репликацијата на ДНК“ и „процес на биосинтеза на пурините“. Во меѓувреме, оние на М4 вклучуваат „диференцијација на глијални клетки“ и „сегрегација на хромозомите“. Панелот за миелинизација содржи 49 маркери за CSF поврзани со мозокот.
Четвртата група содржи најмногу модули (M30, M29, M18, M24 и M5), а скоро сите модули се значително богати со микроглија и астроцитни маркери. Слично на миелинизирачкиот панел, четвртиот панел содржи и модули (M30, M29 и M18) кои се тесно поврзани со клеточната пролиферација. Другите модули во оваа група се многу поврзани со имунолошки термини, како што се „процес на имунолошки ефект“ (M5) и „регулација на имунолошкиот одговор“ (M24). Глијалната имунолошка група содржи 42 маркери за ЦСФ поврзани со мозокот. Конечно, последниот панел вклучува 52 маркери поврзани со мозокот на четирите модули (M44, M3, M33 и M38), од кои сите се на телото поврзани со складирањето на енергија и метаболизмот. Најголемиот од овие модули (М3) е тесно поврзан со митохондриите и е богат со маркери специфични за невронот. M38 е еден од помалите членови на модулот во овој метаболом и исто така покажува умерена специфичност на невронот.
Севкупно, овие пет панели рефлектираат широк спектар на типови и функции на клетки во кортексот на АД и колективно содржат 271 маркери за цереброспинална течност поврзани со мозокот (Табела S2G). Со цел да се оцени валидноста на овие резултати од МС, ја користевме анализата за проширување на близина (ПЕА), технологија заснована на ортогонални антитела со способности за мултиплексирање, висока чувствителност и специфичност и ги реанализиравме примероците од цереброспиналната течност што ги најдовме Подгрупа од овие 271 биомаркери (n = 36). Овие 36 цели ја демонстрираат промената во AD мултиплитот на PEA, што е тесно поврзано со нашите наоди засновани на MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), што силно ги потврди резултатите од нашата сеопфатна MS анализа (Слика S4 ).
Биолошките теми нагласени од нашите пет групи, од синаптичко сигнализирање до енергетскиот метаболизам, сите се поврзани со патогенезата на АД (1-3). Затоа, сите 15 модули кои ги содржат овие панели се поврзани со патологијата на АД во протеомот на мозокот што ја откривме (Слика 2Б). Најзабележителна е високата позитивна патолошка корелација помеѓу нашите глијални модули и силната негативна патолошка корелација помеѓу нашите најголеми невронски модули (М1 и М3). Анализата на диференцијалната експресија на нашиот реплициран мозочен протеом (Слика S3D) исто така ги истакнува глијалните протеини добиени од М5 и М18. Кај AsymAD и симптоматската АД, најмногу зголемени глијални протеини и синапси поврзани со М1 Протеинот е најмногу намален. Овие набљудувања покажуваат дека 271 маркери на цереброспиналната течност што ги идентификувавме во петте групи се поврзани со процесите на болеста во кортексот на АД, вклучувајќи ги и оние што се јавуваат во раните асимптоматски фази.
Со цел подобро да ја анализираме насоката на промена на протеините на панелот во мозокот и спиналната течност, го нацртавме следново за секој од 15-те модули кои се преклопуваат: (i) го најдовме нивото на изобилство на модулот во множеството податоци за мозокот и (ii) модулот протеин Разликата е изразена во цереброспиналната течност (слика S5). Како што споменавме порано, WGCNA се користи за да се одреди изобилството на модулот или карактеристичната вредност на протеините во мозокот (13). Картата на вулканите се користи за опишување на диференцијалната експресија на модуларните протеини во цереброспиналната течност (АД/контрола). Овие бројки покажуваат дека три од петте панели покажуваат различни трендови на изразување во мозокот и спиналната течност. Двата модула на панелот за синапси (М1 и М12) покажуваат намалување на нивото на изобилство во мозокот на АД, но значително се преклопуваат со зголемениот протеин во АД ЦСФ (слика S5A). Модулите поврзани со невронот кои го содржат метаболомот (M3 и M38) покажаа слични модели на изразување на мозокот и цереброспиналната течност неконзистентни (Слика S5E). Васкуларниот панел, исто така, покажа различни трендови на изразување, иако неговите модули (M6 и M15) беа умерено зголемени во мозокот на АД и намалени во заболениот CSF (Слика S5B). Преостанатите два панели содржат големи глијални мрежи чии протеини се постојано нагоре регулирани во двата одделенија (слика S5, C и D).
Ве молиме имајте предвид дека овие трендови не се заеднички за сите маркери во овие панели. На пример, синаптичкиот панел вклучува неколку протеини кои се значително намалени во АД мозокот и CSF (Слика S5A). Меѓу овие надолно регулирани маркери на цереброспиналната течност се NPTX2 и VGF од М1, и хромогранин Б од М12. Сепак, и покрај овие исклучоци, повеќето од нашите синаптички маркери се покачени во АД спиналната течност. Генерално, овие анализи беа во можност да разликуваат статистички значајни трендови во нивото на мозокот и цереброспиналната течност во секој од нашите пет панели. Овие трендови ја нагласуваат сложената и често различна врска помеѓу експресијата на протеинот на мозокот и цереброспиналната течност во АД.
Потоа, користевме анализа на репликација на MS со висок промет (репликација на CSF 1) за да го стесниме нашиот 271 сет на биомаркери до најперспективните и репродуктивни цели (Слика 5А). Копијата 1 на CSF содржи вкупно 96 примероци од Emory Goizueta ADRC, вклучувајќи контролна, AsymAD и AD група (Табела S1A). Овие случаи на АД се карактеризираат со благ когнитивен пад (просечно МСУ, 20,0 ± 3,8) и промени во биомаркерите на АД потврдени во цереброспиналната течност (Табела S1A). Спротивно на анализата на цереброспиналната течност што ја најдовме, оваа репликација се изведува со користење на поефикасна и високопропусна метода „еднократно“ MS (без фракционирање надвор од линијата), вклучително и поедноставен протокол за подготовка на примерок кој ја елиминира потребата за имунодеплеција на поединечни примероци . Наместо тоа, се користи единствен „канал за подобрување“ со осиромашен имунитет за да се засили сигналот на помалку изобилни протеини (37). Иако ја намалува вкупната покриеност со протеом, овој метод со еднократно снимање значително го намалува времето на машината и го зголемува бројот на примероци означени со TMT кои можат да се анализираат остварливи (17, 38). Севкупно, анализата идентификуваше 6.487 пептиди, кои беа мапирани на 1.183 протеоми во 96 случаи. Како и со анализата на цереброспиналната течност што ја откривме, само оние протеини квантифицирани во најмалку 50% од примероците беа вклучени во последователните пресметки, а податоците беа регресирани за ефектите од возраста и полот. Ова доведе до конечна квантификација на 792 протеоми, од кои 95% беа исто така идентификувани во пронајдениот сет на податоци CSF.
(А) Целите на протеините на CSF поврзани со мозокот потврдени во првата реплицирана група на CSF и вклучени во завршниот панел (n = 60). (Б до Д) Нивоа на биомаркери на панелот (композитни z-оценки) измерени во четирите групи за репликација на CSF. Спарени t-тестови или ANOVA со пост-корекција на Tukey беа користени за да се оцени статистичката значајност на промените во изобилството во секоја реплика анализа. КТ, контрола.
Бидејќи ние сме особено заинтересирани да ги потврдиме нашите 271 цели на цереброспиналната течност поврзани со мозокот преку сеопфатна анализа, ќе го ограничиме понатамошното испитување на овој реплициран протеом на овие маркери. Помеѓу овие 271 протеин, 100 беа откриени во репликација на CSF 1. Сликата S6A го покажува диференцијалното изразување на овие 100 маркери кои се преклопуваат помеѓу контролните и примероците за репликација на АД. Синаптичките и метаболитните хистони се зголемуваат најмногу кај АД, додека васкуларните протеини се намалуваат најмногу кај болеста. Повеќето од 100-те маркери кои се преклопуваат (n = 70) ја задржаа истата насока на промена во двете групи на податоци (Слика S6B). Овие 70 потврдени маркери за цереброспинална течност поврзани со мозокот (Табела S2H) во голема мера ги рефлектираат претходно забележаните трендови на изразување на панелот, односно, надолната регулација на васкуларните протеини и нагорната регулација на сите други панели. Само 10 од овие 70 потврдени протеини покажаа промени во изобилството на АД што беа во спротивност со овие трендови на панелот. Со цел да генерираме панел кој најдобро го одразува целокупниот тренд на мозокот и цереброспиналната течност, ги исклучивме овие 10 протеини од панелот на интерес што конечно го потврдивме (Слика 5А). Затоа, нашиот панел на крајот вклучува вкупно 60 протеини потврдени во две независни групи на CSF AD со користење на различна подготовка на примерок и анализа на MS платформата. Цртежите на изразување со z-резултат на овие завршни панели во случаите за контрола на CSF копијата 1 и AD го потврдија трендот на панелот забележан во групата CSF што ја најдовме (Слика 5Б).
Меѓу овие 60 протеини, постојат молекули за кои се знае дека се поврзани со АД, како што е остеопонтин (SPP1), кој е проинфламаторен цитокин кој е поврзан со АД во многу студии (39-41) и GAP43, синаптички протеин што е јасно поврзано со невродегенерација (42). Најцелосно потврдени протеини се маркери поврзани со други невродегенеративни болести, како што е амиотрофичната латерална склероза (ALS) поврзана со супероксид дисмутаза 1 (SOD1) и десахараза поврзана со Паркинсонова болест (PARK7). Ние, исто така, потврдивме дека многу други маркери, како што се SMOC1 и сигналниот протеин 1 за прицврстување на мембраната богат со мозок (BASP1), ги ограничиле претходните врски со невродегенерацијата. Вреди да се напомене дека поради нивното ниско севкупно изобилство во протеомот на цереброспиналната течност, тешко ни е да го користиме овој метод за откривање со еден истрел со висок процент за со сигурност да откриеме MAPT и одредени други протеини поврзани со АД (на пример, NEFL и NRGN ) ( 43, 44).
Потоа ги проверивме овие 60 маркери на приоритетни панели во три дополнителни реплика анализи. Во CSF Copy 2, користевме еден TMT-MS за да анализираме независна група од 297 контролни и AD примероци од Emory Goizueta ADRC (17). Репликацијата на CSF 3 вклучуваше реанализа на достапните TMT-MS податоци од 120 контролни и АД пациенти од Лозана, Швајцарија (45). Откривме повеќе од две третини од 60-те приоритетни маркери во секоја база на податоци. Иако швајцарската студија користеше различни MS платформи и методи за квантификација на TMT (45, 46), ние силно ги репродуциравме нашите трендови на панелот во две повторени анализи (слика 5, C и D, и табели S2, I и J). За да ја оцениме специфичноста на болеста на нашата група, користевме TMT-MS за да го анализираме четвртиот сет на податоци за репликација (CSF репликација 4), кој вклучуваше не само контролни (n = 18) и AD (n = 17) случаи, туку и ПД ( n = 14)), ALS (n = 18) и примероци од фронтотемпорална деменција (FTD) (n = 11) (Табела S1A). Успешно квантифициравме скоро две третини од панелните протеини во оваа група (38 од 60). Овие резултати ги истакнуваат промените специфични за АД во сите пет панели за биомаркери (Слика 5E и Табела S2K). Зголемувањето на групата на метаболити покажа најсилна специфичност на АД, проследено со миелинизација и глијална група. Во помала мера, FTD, исто така, покажува зголемување помеѓу овие панели, што може да рефлектира слични потенцијални промени во мрежата (17). Спротивно на тоа, ALS и PD покажаа скоро исти профили на миелинизација, глијали и метаболом како контролната група. Севкупно, и покрај разликите во подготовката на примерокот, MS платформата и методите за квантификација на TMT, овие повторени анализи покажуваат дека нашите приоритетни панел-маркери имаат многу конзистентни промени специфични за АД во повеќе од 500 уникатни примероци на CSF.
Невродегенерацијата на АД е широко препознаена неколку години пред почетокот на когнитивните симптоми, така што постои итна потреба за биомаркери на AsymAD (5, 31). Сепак, се повеќе и повеќе докази покажуваат дека биологијата на AsymAD е далеку од хомогена, а сложената интеракција на ризикот и еластичноста води до големи индивидуални разлики во последователната прогресија на болеста (47). Иако се користат за да се идентификуваат случаите на AsymAD, нивоата на биомаркери на CSF (Aβ1-42, вкупно тау и p-tau) не се покажаа како способни со сигурност да предвидат кој ќе напредува до деменција (4, 7), што укажува на повеќе. неопходно е да се вклучат холистички алатки за биомаркери базирани на повеќе аспекти на физиологијата на мозокот за прецизно да се раслојува ризикот од оваа популација. Затоа, ние последователно го анализиравме нашиот биомаркерски панел потврден со АД во AsymAD популацијата на CSF копија 1. Овие 31 случај на AsymAD покажаа абнормални нивоа на основни биомаркери (Aβ1-42/вкупен сооднос tau ELISA, <5,5) и целосно когниција (просечно MoCA, 271. ± 2.2) (Табела S1A). Дополнително, сите индивидуи со AsymAD имаат оцена за клиничка деменција од 0, што покажува дека нема докази за пад на дневните когнитивни или функционални перформанси.
Прво ги анализиравме нивоата на потврдените панели во сите 96 CSF реплики 1, вклучувајќи ја и групата AsymAD. Откривме дека неколку панели во групата AsymAD имале значителни промени во изобилството слични на АД, васкуларниот панел покажа надолен тренд во AsymAD, додека сите други панели покажаа нагорен тренд (Слика 6А). Затоа, сите панели покажаа многу значајна корелација со ELISA Aβ1-42 и вкупните нивоа на тау (Слика 6Б). Спротивно на тоа, корелацијата помеѓу групата и резултатот на МСУ е релативно лоша. Еден од повпечатливите наоди од овие анализи е големиот опсег на изобилство на панели во групата AsymAD. Како што е прикажано на слика 6А, нивото на панелот на групата AsymAD обично го преминува нивото на панелот на контролната група и групата АД, покажувајќи релативно висока варијабилност. За дополнително да ја истражиме оваа хетерогеност на AsymAD, применивме анализа на мултидимензионално скалирање (MDS) на 96 случаи на репликација на CSF 1. Анализата на MDS овозможува да се визуелизира сличноста помеѓу случаите врз основа на одредени променливи во множеството податоци. За оваа кластерска анализа, ги користиме само оние потврдени панел-маркери кои имаат статистички значајна промена (P <0,05, AD/контрола) во нивото на откривање и репликација на CSF 1 протеом (n = 29) (Табела S2L). Оваа анализа произведе јасно просторно групирање помеѓу нашата контрола и случаите на АД (Слика 6В). Спротивно на тоа, некои случаи на AsymAD се јасно групирани во контролната група, додека други се лоцирани во случаи на АД. За дополнително да ја истражиме оваа хетерогеност на AsymAD, ја користевме нашата MDS карта за да дефинираме две групи од овие случаи на AsymAD. Првата група вклучува случаи на AsymAD групирани поблиску до контролата (n = 19), додека втората група се карактеризира со случаи на AsymAD со профил на маркер поблиску до АД (n = 12).
(А) Нивото на изразување (z-резултат) на групата биомаркери на CSF во сите 96 примероци во групата CSF репликација 1, вклучувајќи го и AsymAD. Анализата на варијансата со пост-корекција на Туки беше искористена за да се оцени статистичката значајност на промените во изобилството на панелите. (Б) Анализа на корелација на нивото на изобилство на панел протеин (z-резултат) со резултат на MoCA и вкупно ниво на тау во ELISA Aβ1-42 и CSF копија 1 примероци. Се прикажува коефициентот на корелација на Пирсон со релевантната вредност P. (В) МДС од 96 случаи на CSF копија 1 се засноваше на нивоата на изобилство од 29 потврдени панел-маркери, кои беа значително променети и во множеството податоци за откривање и CSF копија 1 [P <0,05 AD/контрола (CT)]. Оваа анализа беше искористена за да се подели AsymAD групата на контролни (n = 19) и AD (n = 12) подгрупи. (Г) Графикот на вулканот го покажува диференцијалното изразување на сите протеини за репликација 1 CSF со промена на log2 пати (x-оска) во однос на -log10 статистичката P вредност помеѓу двете AsymAD подгрупи. Биомаркерите на панелот се обоени. (Д) Нивото на изобилство на репликација на CSF 1 на биомаркерите на групата за избор се различно изразени помеѓу подгрупите AsymAD. Пост-прилагодената анализа на варијансата на Tukey беше искористена за да се процени статистичката значајност.
Ја испитувавме диференцијалната протеинска експресија помеѓу овие контролни и случаи на AsymAD слични на АД (Слика 6Д и Табела S2L). Добиената карта на вулканите покажува дека 14 маркери на панели значително се промениле помеѓу двете групи. Повеќето од овие маркери се членови на синапсата и метаболомот. Сепак, SOD1 и миристоилирана супстрат од протеин киназа C богата со аланин (MARCKS), кои се членови на миелинската и глијалната имун група, соодветно, исто така припаѓаат на оваа група (слика 6, D и E). Васкуларниот панел, исто така, придонесе два маркери кои беа значително намалени во групата AsymAD слична на АД, вклучително и AE врзувачкиот протеин 1 (AEBP1) и членот на семејството на комплементот C9. Немаше значајна разлика помеѓу контролните и подгрупите AsymAD слични на АД во ELISA AB1-42 (P = 0,38) и p-tau (P = 0,28), но навистина имаше значајна разлика во вкупното ниво на тау (P = 0,0031 ) (сл. S7). Постојат неколку маркери на панели кои покажуваат дека промените помеѓу двете подгрупи AsymAD се позначајни од вкупните нивоа на тау (на пример, YWHAZ, SOD1 и MDH1) (Слика 6E). Генерално, овие резултати покажуваат дека нашиот потврден панел може да содржи биомаркери кои можат да подтип и потенцијален ризик стратификација на пациенти со асимптоматска болест.
Постои итна потреба од системски алатки за биомаркери за подобро мерење и насочување на различните патофизиологија зад АД. Од овие алатки се очекува не само да ја променат нашата дијагностичка рамка за АД, туку и да промовираат усвојување на ефективни стратегии за третман специфични за пациентот (1, 2). За таа цел, применивме непристрасен сеопфатен протеомски пристап кон АД мозокот и цереброспиналната течност за да ги идентификуваме биомаркерите на цереброспиналната течност базирани на веб кои рефлектираат широк опсег на патофизиологија базирана на мозокот. Нашата анализа произведе пет биомаркери на CSF панели, кои (i) ги рефлектираат синапсите, крвните садови, миелинот, имунолошкиот и метаболичката дисфункција; (ii) демонстрира силна репродуктивност на различни MS платформи; (iii) Прикажи прогресивни промени специфични за болеста во текот на раните и доцните стадиуми на АД. Генерално, овие наоди претставуваат ветувачки чекор кон развојот на разновидни, сигурни, веб-ориентирани алатки за биомаркери за истражување на АД и клинички апликации.
Нашите резултати ја демонстрираат високо зачуваната организација на протеомот на мозочната мрежа на АД и ја поддржуваат неговата употреба како сидро за развој на системски биомаркери. Нашата анализа покажува дека две независни сетови на податоци на TMT-MS кои содржат мозоци AD и AsymAD имаат силна модуларност. Овие наоди ја прошируваат нашата претходна работа, демонстрирајќи го зачувувањето на моќните модули на повеќе од 2.000 мозочни ткива од повеќе независни групи во фронталниот, париеталниот и темпоралниот кортекс (17). Оваа консензус мрежа одразува различни промени поврзани со болести забележани во тековните истражувања, вклучувајќи го и зголемувањето на воспалителните модули богати со глијали и намалувањето на модулите богати со неврони. Како и сегашните истражувања, оваа мрежа од големи размери, исто така, има значајни модуларни промени во AsymAD, покажувајќи разновидна различна претклиничка патофизиологија (17).
Меѓутоа, во оваа висококонзервативна системска рамка, постои повеќе ситно-грануларна биолошка хетерогеност, особено кај поединците во раните фази на АД. Нашиот панел за биомаркер може да прикаже две подгрупи во AsymAD, кои ја демонстрираат значајната диференцијална експресија на повеќе маркери на CSF. Нашата група можеше да ги истакне биолошките разлики помеѓу овие две подгрупи, кои не беа очигледни на ниво на основни биомаркери на АД. Во споредба со контролната група, односот Aβ1-42/вкупен тау на овие AsymAD индивидуи беа ненормално ниски. Сепак, само вкупните нивоа на тау беа значително различни помеѓу двете подгрупи AsymAD, додека нивоата на Aβ1-42 и p-tau останаа релативно споредливи. Со оглед на тоа што се чини дека високиот тау на CSF е подобар предиктор на когнитивните симптоми од нивоата на Aβ1-42 (7), се сомневаме дека двете групи на AsymAD може да имаат различни ризици од прогресија на болеста. Со оглед на ограничената големина на примерокот на нашата AsymAD и недостатокот на надолжни податоци, потребни се дополнителни истражувања за самоуверено да се извлечат овие заклучоци. Сепак, овие резултати покажуваат дека панелот за CSF базиран на систем може да ја подобри нашата способност ефикасно да ги раслојуваме поединците за време на асимптоматската фаза на болеста.
Генерално, нашите наоди ја поддржуваат улогата на повеќе биолошки функции во патогенезата на АД. Сепак, нерегулираниот енергетски метаболизам стана истакната тема на сите наши пет потврдени панели за етикетирање. Метаболичките протеини, како што се хипоксантин-гванин фосфорибосилтрансфераза 1 (HPRT1) и лактат дехидрогеназа А (LDHA), се најцврсто потврдените синаптички биомаркери, што укажува дека зголемувањето на AD CSF е многу репродуктивен пол. Нашите крвни садови и глијални панели, исто така, содржат неколку маркери вклучени во метаболизмот на оксидативните супстанции. Овие наоди се во согласност со клучната улога што метаболичките процеси ја играат во целиот мозок, не само за да се задоволат високите енергетски потреби на невроните, туку и да се задоволат високите енергетски потреби на астроцитите и другите глијални клетки (17, 48). Нашите резултати поддржуваат растечки докази дека промените во редокс потенцијалот и прекинот на енергетските патишта може да бидат основната врска помеѓу неколку клучни процеси вклучени во патогенезата на АД, вклучително и митохондријални нарушувања, воспаление посредувано од глијали и васкуларно оштетување (49). Дополнително, биомаркерите на метаболичката цереброспинална течност содржат голем број на диференцијално богати протеини помеѓу нашата контрола и подгрупите AsymAD слични на АД, што укажува на тоа дека нарушувањето на овие енергетски и редокс патишта може да биде критично во претклиничката фаза на болеста.
Различните трендови на панелот на мозокот и цереброспиналната течност што ги забележавме, исто така, имаат интересни биолошки импликации. Синапсите и метаболомите богати со неврони покажуваат намалени нивоа во мозокот на АД и зголемено изобилство во цереброспиналната течност. Имајќи предвид дека невроните се богати со митохондрии кои произведуваат енергија во синапсите за да обезбедат енергија за нивните бројни специјализирани сигнали (50), се очекува сличноста на профилите на изразување на овие две невронски групи. Губењето на невроните и истиснувањето на оштетените клетки може да ги објаснат овие трендови на панелот на мозокот и цереброспиналната течност во подоцнежната болест, но тие не можат да ги објаснат раните промени на панелот што ги забележуваме (13). Едно можно објаснување за овие наоди кај раната асимптоматска болест е абнормалното синаптичко кастрење. Новите докази во моделите на глувци сугерираат дека синаптичката фагоцитоза посредувана од микроглија може да биде ненормално активирана во АД и да доведе до рано губење на синапсите во мозокот (51). Овој отфрлен синаптички материјал може да се акумулира во цереброспиналната течност, поради што го набљудуваме зголемувањето на цереброспиналната течност во невронскиот панел. Синаптичкото кастрење со имуно посредство може делумно да го објасни и зголемувањето на глијалните протеини што ги забележуваме во мозокот и цереброспиналната течност во текот на процесот на болеста. Покрај синаптичкото кастрење, севкупните абнормалности во егзоцитната патека може да доведат и до различни изрази на мозокот и цереброспиналната течност на невронските маркери. Голем број на студии покажаа дека содржината на егзосомите во патогенезата на мозокот на АД е променета (52). Екстрацелуларниот пат е исто така вклучен во пролиферацијата на Aβ (53, 54). Вреди да се напомене дека сузбивањето на егзосомната секреција може да ја намали патологијата слична на АД кај трансгенските модели на глувци со АД (55).
Во исто време, протеинот во васкуларниот панел покажа умерено зголемување на АД мозокот, но значително намален во цереброспиналната течност. Дисфункција на крвно-мозочната бариера (BBB) може делумно да ги објасни овие наоди. Многу независни постмортални студии на луѓе покажаа распаѓање на БББ во АД (56, 57). Овие студии потврдија различни абнормални активности кои го опкружуваат овој цврсто затворен слој на ендотелијални клетки, вклучително и истекување на мозочните капилари и периваскуларна акумулација на протеини кои се пренесуваат преку крвта (57). Ова може да даде едноставно објаснување за покачените васкуларни протеини во мозокот, но не може целосно да го објасни исцрпувањето на истите овие протеини во цереброспиналната течност. Една од можностите е дека централниот нервен систем активно ги изолира овие молекули за да го реши проблемот со зголеменото воспаление и оксидативниот стрес. Намалувањето на некои од најтешките CSF протеини во овој панел, особено оние кои се вклучени во регулацијата на липопротеините, е поврзано со инхибицијата на штетните нивоа на воспаление и невропротективниот процес на реактивните видови кислород. Ова е точно за Пароксоназа 1 (PON1), ензим за врзување на липопротеини одговорен за намалување на нивото на оксидативен стрес во циркулацијата (58, 59). Алфа-1-микроглобулин/бикунин прекурсор (AMBP) е уште еден значително намалено регулиран маркер на васкуларната група. Тој е претходник на липидниот транспортер бикунин, кој исто така е вклучен во супресија на воспалението и невролошка заштита (60, 61).
И покрај различните интересни хипотези, неможноста директно да се детектираат механизмите на биохемиската болест е добро познато ограничување на протеомската анализа водена од откритија. Затоа, потребни се дополнителни истражувања за самоуверено да се дефинираат механизмите зад овие биомаркери панели. Со цел да се придвижи кон развој на клиничка анализа базирана на MS, идната насока, исто така, бара употреба на насочени квантитативни методи за верификација на биомаркери од големи размери, како што е селективно или паралелно следење на реакцијата (62). Неодамна користевме паралелно следење на реакцијата (63) за да потврдиме многу од промените на CSF протеинот опишани овде. Неколку приоритетни цели на панели се квантифицирани со значителна точност, вклучувајќи ги YWHAZ, ALDOA и SMOC1, кои се мапираат на нашите панели за синапси, метаболизам и воспаление, соодветно (63). Независно стекнување податоци (DIA) и други стратегии засновани на MS, исто така, може да бидат корисни за проверка на целта. Буд и сор. 64. Овие неодамнешни студии го поддржуваат потенцијалот на нашите панели да се трансформираат во доверливо откривање базирано на MS. Традиционалното откривање базирано на антитела и аптамер е исто така важно за понатамошниот развој на клучните биомаркери на АД. Поради ниското изобилство на цереброспинална течност, потешко е да се детектираат овие биомаркери со помош на методи на MS со висока пропусност. NEFL и NRGN се два такви примери на биомаркери на CSF со мала изобилство, кои се мапирани на панелот во нашата сеопфатна анализа, но не можат со сигурност да се откријат со помош на нашата единствена стратегија за MS. Стратегиите за таргетирање базирани на повеќе антитела, како што е PEA, може да ја промовираат клиничката трансформација на овие маркери.
Севкупно, оваа студија обезбедува уникатен протеомски пристап за идентификација и верификација на биомаркерите на CSF AD врз основа на различни системи. Оптимизирањето на овие панели за маркери низ дополнителни AD групи и MS платформи може да се покаже ветувачко за унапредување на стратификацијата и третманот на ризикот од АД. Студиите кои го оценуваат надолжното ниво на овие панели со текот на времето се исто така клучни за да се одреди која комбинација на маркери најдобро го раслојува ризикот од рана болест и промени во тежината на болеста.
Освен 3-те примероци копирани од CSF, сите примероци од CSF користени во оваа студија беа собрани под покровителство на Emory ADRC или тесно поврзани истражувачки институции. Во овие протеомски студии беа користени вкупно четири групи на примероци од Емори CSF. Беше откриено дека групата на CSF содржи примероци од 20 здрави контроли и 20 пациенти со АД. Копијата 1 на CSF вклучува примероци од 32 здрави контроли, 31 AsymAD индивидуи и 33 AD поединци. Копијата 2 на CSF содржи 147 контроли и 150 примероци од АД. Кохортата за репликација на CSF со повеќе болести 4 вклучуваше 18 контроли, 17 АД, 19 АЛС, 13 ПД и 11 примероци на ФТД. Според договорот одобрен од Одборот за институционален преглед на Универзитетот Емори, сите учесници во студијата на Емори добија информирана согласност. Според Насоките за најдобри практики на Националниот институт за стареење од 2014 година за центрите за Алцхајмеровата болест (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), цереброспиналната течност беше собрана и складирана со лумбална пункција. Контролните и пациентите AsymAD и AD добија стандардизирана когнитивна проценка во клиниката за когнитивна неврологија Емори или Goizueta ADRC. Нивните примероци од цереброспиналната течност беа тестирани од INNO-BIA AlzBio3 Luminex за ELISA Aβ1-42, вкупна тау и p-tau анализа (65). Вредностите на ELISA се користат за поддршка на дијагностичката класификација на субјектите врз основа на утврдените критериуми за исклучување на биомаркерите на АД (66, 67). Основните демографски и дијагностички податоци за други дијагнози на CSF (FTD, ALS и PD) се исто така добиени од Emory ADRC или поврзани истражувачки институции. Збирните метаподатоци за случаите за овие случаи на Емори CSF може да се најдат во Табела S1A. Карактеристиките на швајцарската CSF репликација 3 група се претходно објавени (45).
CSF го најде примерокот. Со цел да се зголеми длабочината на нашето откритие на множеството податоци за цереброспиналната течност, имунолошката потрошувачка на протеини со голема количина беше извршена пред трипсинизацијата. Накратко, 130 μl CSF од 40 поединечни примероци на CSF и еднаков волумен (130 μl) смола за осиромашување на протеини со висок избор Топ 14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) беа ставени во колона за центрифугирање (Thermo Fisher Scientific, A89868) во просторијата температура Инкубираат). Откако ќе се врти 15 минути, се центрифугира примерокот на 1000 g за 2 минути. Уредот за ултрацентрифугален филтер 3K (Milipore, UFC500396) беше искористен за концентрирање на примерокот од ефлуентот со центрифугирање на 14.000 g за 30 минути. Разредете ги сите волумени на мострата до 75 μl со физиолошки раствор со фосфат пуфер. Концентрацијата на протеинот беше оценета со методот на бицинхонинска киселина (BCA) според протоколот на производителот (Thermo Fisher Scientific). Имунодефицираниот CSF (60 μl) од сите 40 примероци беше дигестиран со лизил ендопептидаза (LysC) и трипсин. Накратко, примерокот беше редуциран и алкилизиран со 1,2 μl 0,5 М трис-2(-карбоксиетил)-фосфин и 3 μl 0,8 М хлороацетамид на 90°C во тек на 10 минути, а потоа се озонира во водена бања 15 минути. Примерокот беше разреден со 193 μl 8 M уреа пуфер [8 M уреа и 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] до конечна концентрација од 6 M уреа. LysC (4,5 μg; Wako) се користи за варење преку ноќ на собна температура. Примерокот потоа беше разреден до 1 M уреа со 50 mM амониум бикарбонат (ABC) (68). Додадете еднаква количина (4,5 μg) трипсин (Promega), а потоа инкубирајте го примерокот 12 часа. Закиселете го варениот раствор на пептид до конечна концентрација од 1% мравја киселина (FA) и 0,1% трифлуорооцетна киселина (TFA) (66), а потоа отстранете ја солта со 50 mg Sep-Pak C18 колона (Води) како што е опишано погоре (25) . Пептидот потоа беше елуиран во 1 ml од 50% ацетонитрил (ACN). За да се стандардизира квантификацијата на протеините во сериите (25), делови од 100 μl од сите 40 примероци CSF беа комбинирани за да се генерира мешан примерок, кој потоа беше поделен на пет примероци на глобален внатрешен стандард (ГИС) (48). Сите поединечни примероци и комбинирани стандарди се сушат со вакуум со голема брзина (Labconco).
CSF го копира примерокот. Дејон и неговите колеги претходно опишаа имуно осиромашување и варење на цереброспиналната течност копираат 3 примероци (45, 46). Останатите реплика на примероци не беа поединечно имуноослабени. Варете ги овие неотстранети примероци во трипсин како што е опишано претходно (17). За секоја повторена анализа, делови од 120 μl од елутираниот пептид од секој примерок беа здружени заедно и поделени на делови со еднаков волумен за да се користат како глобален внатрешен стандард означен со TMT (48). Сите поединечни примероци и комбинирани стандарди се сушат со вакуум со голема брзина (Labconco). Со цел да се подобри сигналот на протеинот CSF со ниска изобилство, со комбинирање на 125 μl од секој примерок, беше подготвен „подобрен“ примерок за секоја реплика анализа [т.е. биолошки примерок што го имитира истражуваниот примерок, но количината на располагање е многу поголем (37, 69)] споен во мешан примерок CSF (17). Мешаниот примерок потоа беше имуно отстранет со употреба на 12 ml смола за отстранување на протеин со висока селекција Топ14 (Thermo Fisher Scientific, A36372), варена како што е опишано погоре и вклучена во последователното повеќекратно означување на TMT.
Време на објавување: 27 август 2021 година