Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Термофилите се микроорганизми кои напредуваат на високи температури. Нивното проучување може да обезбеди вредни информации за тоа како животот се прилагодува на екстремните услови. Сепак, тешко е да се постигнат услови за висока температура со конвенционалните оптички микроскопи. Предложени се неколку домашни решенија засновани на локално отпорно електрично греење, но не постои едноставно комерцијално решение. Во овој труд, го воведуваме концептот на ласерско загревање со микроскоп преку видното поле на микроскопот за да обезбедиме високи температури за термофилни студии додека ја одржуваме околината на корисникот блага. Греењето во микроскала со умерен ласерски интензитет може да се постигне со помош на супстрат обложен со златни наночестички како биокомпатибилен и ефикасен апсорбер на светлина. Разгледани се можните ефекти од конвекцијата на течноста во микроскала, задржувањето на клетките и центрифугалното термофоретско движење. Методот е демонстриран во два вида: (i) Geobacillus stearothermophilus, активна термофилна бактерија која се репродуцира на околу 65°C, којашто забележавме дека ртат, растат и пливаат под загревање во микро размери; (ii) Thiobacillus sp., оптимално хипертермофилна археа. на 80°C. Ова дело го отвора патот за едноставно и безбедно набљудување на термофилните микроорганизми со помош на современи и достапни микроскопски алатки.
Во текот на милијарди години, животот на Земјата еволуирал за да се прилагоди на широк опсег на услови на животната средина кои понекогаш се сметаат за екстремни од нашата човечка перспектива. Особено, некои термофилни микроорганизми (бактерии, археи, габи) наречени термофили напредуваат во температурен опсег од 45°C до 122°C1, 2, 3, 4. Термофилите живеат во различни екосистеми, како што се длабоки морски хидротермални отвори, топли извори или вулкански области. Нивното истражување предизвика голем интерес во последните неколку децении од најмалку две причини. Прво, можеме да научиме од нив, на пример, како термофилите 5, 6, ензимите 7, 8 и мембраните 9 се стабилни на толку високи температури, или како термофилите можат да издржат екстремни нивоа на зрачење10. Второ, тие се основа за многу важни биотехнолошки апликации1,11,12 како што се производството на гориво13,14,15,16, хемиската синтеза (дихидро, алкохоли, метан, амино киселини, итн.)17, биоминирање18 и термостабилни бикатализатори7,11, 13. Конкретно, моментално добро познатата полимеразна верижна реакција (PCR)19 вклучува ензим (Taq полимераза) изолиран од термофилната бактерија Thermus aquaticus, една од првите откриени термофили.
Сепак, проучувањето на термофилите не е лесна задача и не може да се импровизира во ниту една биолошка лабораторија. Конкретно, живите термофили не можат да се набљудуваат in vitro со ниту еден стандарден светлосен микроскоп, дури и со комерцијално достапни грејни комори, обично оценети за температури до 40°C. Од 1990-тите, само неколку истражувачки групи се посветија на воведувањето на системи за микроскопија со висока температура (HTM). Во 1994 година, Глух и сор. Комората за греење/ладење е замислена врз основа на употреба на ќелија Пелтие која ја контролира температурата на правоаголните капилари затворени за да се одржи анаеробноста 20 . Уредот може да се загрева до 100 °C со брзина од 2 °C/s, овозможувајќи им на авторите да ја проучат подвижноста на хипертермофилната бактерија Thermotoga maritima21. Во 1999 година Хорн и сор. Развиен е многу сличен уред, сè уште базиран на употреба на загреани капилари погодни за комерцијална микроскопија за проучување на клеточната делба/поврзување. По долг период на релативна неактивност, потрагата по ефективни HTM продолжи во 2012 година, особено во врска со серија трудови од групата Wirth што користеше уред измислен од Хорн и сор. Пред 15 години, подвижноста на голем број археи, вклучително и хипертермофили, беше проучувана на температури до 100°C со помош на загреани капилари23,24. Тие, исто така, го модифицираа оригиналниот микроскоп за да постигнат побрзо загревање (неколку минути наместо 35 минути за да се постигне поставената температура) и да се постигне линеарен температурен градиент од повеќе од 2 cm низ медиумот. Овој уред за обликување на температурен градиент (TGFD) се користи за проучување на мобилноста на многу термофили во температурни градиенти на биолошки релевантни растојанија 24, 25 .
Загревањето на затворените капилари не е единствениот начин да се набљудуваат живите термофили. Во 2012 година, Кувабара и сор. Користени се домашни пирекс комори за еднократна употреба запечатени со лепило отпорно на топлина (Super X2; Cemedine, Јапонија). Примероците беа ставени на комерцијално достапна проѕирна грејна плоча (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Јапонија) способна да се загрева до 110°C, но првично не беше наменета за биоисликување. Авторите забележале ефикасна поделба на анаеробните термофилни бактерии (Thermosipho globiformans, време на удвојување 24 мин) на 65°C. Во 2020 година, Пулшен и сор. Ефикасното загревање на комерцијалните метални садови (AttofluorTM, Thermofisher) беше демонстрирано со користење на два домашни грејни елементи: капак и сцена (конфигурација инспирирана од PCR машина). Оваа асоцијација резултира со еднаква температура на течноста и спречува испарување и кондензација на дното на капакот. Употребата на О-прстен ја избегнува размената на гасови со околината. Овој HTM, наречен Сулфоскоп, беше користен за сликање на Sulfolobus acidocaldarius на 75°C27.
Препознатливо ограничување на сите овие системи беше ограничувањето на употребата на воздушни цели, бидејќи секое потопување масло не е соодветно за толку висока температура и за сликање преку проѕирни примероци со дебелина > 1 mm. Препознатливо ограничување на сите овие системи беше ограничувањето на употребата на воздушни цели, бидејќи секое потопување масло не е соодветно за толку висока температура и за сликање преку проѕирни примероци со дебелина > 1 mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничени на использование воздушных объективов, поскольку любое иммерсионное погружение во масло не подходило для такой высокизациой температурен и для резултат 1 мм. Препознатлив недостаток на сите овие системи беше ограничувањето на употребата на воздушни цели, бидејќи секое потопување масло не беше погодно за толку висока температура и за визуелизација преку проѕирни примероци дебели > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合迁毫米厚的透明样品成像. Препознатливо ограничување на сите овие системи е ограничувањето на користењето огледало со вдишување на воздух, бидејќи секое потопување на масло е несоодветно за сликање на проѕирни примероци дебели >1 mm при толку високи температури. Общепризнанным недостижен всех овој систем является ограниченое использование воздушных объективов, любое иммерсионное погружение во масло непригодно за таких высоких температур и визуализации черезы >1. Препознатлив недостаток на сите овие системи е ограничената употреба на воздушни леќи, секое потопување масло е несоодветно за толку високи температури и визуелизација преку проѕирни примероци дебели >1 мм.Во поново време, ова ограничување беше отстрането од Чарлс-Орзаг и сор. 28, кој разви уред кој повеќе не обезбедува топлина околу системот на интерес, туку внатре во самото капак стакло, покриено со тенок проѕирен слој на отпорник направен од ITO (индиум-калај оксид). Капакот може да се загрее до 75 °C со поминување на електрична струја низ проѕирниот слој. Сепак, авторот мора и да ја загрее леќата до објективот, но не повеќе од 65 °C, за да не ја оштети.
Овие дела покажуваат дека развојот на ефикасна оптичка микроскопија со висока температура не е широко прифатена, често бара домашна опрема и често се постигнува по цена на просторна резолуција, што е сериозен недостаток имајќи предвид дека термофилните микроорганизми не се поголеми од неколку микрометри. Намалениот волумен на греење е клучот за решавање на три вродени проблеми на HTM: лоша просторна резолуција, висока топлинска инерција кога системот се загрева и штетно загревање на околните елементи (потопно масло, објективна леќа… или раце на корисникот) при екстремни температури. ).
Во овој труд, воведуваме HTM за набљудување на термофили што не се заснова на отпорно загревање. Наместо тоа, постигнавме локализирано загревање во ограничен дел од видното поле на микроскопот со ласерско зрачење на супстрат што апсорбира светлина. Дистрибуцијата на температурата беше визуелизирана со помош на квантитативна фазна микроскопија (QPM). Ефективноста на овој метод е докажана со Geobacillus stearothermophilus, подвижна термофилна бактерија која се репродуцира на околу 65°C и има кратко време на удвојување (околу 20 минути) и Sulfolobus shibatae, хипертермофил кој оптимално расте на 80°C (archae) да се илустрира. Нормалната стапка на репликација и пливањето беа забележани како функција на температурата. Овој ласерски HTM (LA-HTM) не е ограничен од дебелината на капакот или од природата на целта (потопување со воздух или масло). Ова овозможува да се користат сите леќи со висока резолуција на пазарот. Исто така, не страда од бавно загревање поради топлинска инерција (постигнува моментално загревање во размер од милисекунда) и користи само комерцијално достапни компоненти. Единствените нови безбедносни грижи се поврзани со присуството на моќни ласерски зраци (обично до 100 mW) во внатрешноста на уредот, а можеби и преку очите, за кои се потребни заштитни очила.
Принципот на LA-HTM е да се користи ласер за загревање на примерокот локално во видното поле на микроскопот (сл. 1а). За да го направите ова, примерокот мора да апсорбира светлина. За да користиме разумна ласерска моќност (помалку од 100 mW), не се потпиравме на апсорпцијата на светлината од течниот медиум, туку вештачки ја зголемивме апсорпцијата на примерокот со премачкување на подлогата со златни наночестички (сл. 1в). Загревањето на златни наночестички со светлина е од фундаментално значење за полето на топлинската плазмоника, со очекувани примени во биомедицината, нанохемијата или собирањето сончева светлина29,30,31. Во текот на изминатите неколку години, го користевме овој LA-HTM во неколку студии поврзани со примена на топлинска плазма во физиката, хемијата и биологијата. Главната тешкотија со овој метод е во прикажувањето на конечниот температурен профил, бидејќи покачената температура е ограничена на регион во микроскала во примерокот. Покажавме дека мапирањето на температурата може да се постигне со интерферометар со попречно смолкнување со четири бранови должини, едноставен, со висока резолуција и многу чувствителен метод на квантитативна фазна микроскопија заснован на употреба на дводимензионални дифракциони решетки (исто така познати како вкрстени решетки) 33,34,35,36. Веродостојноста на оваа техника на термичка микроскопија, базирана на микроскопија на брановиот фронт со вкрстени решетки (CGM), е докажана во десетина трудови објавени во изминатата деценија37,38,39,40,41,42,43.
Шема на поставување на паралелно ласерско греење, обликување и температурен микроскоп. б Геометрија на примерок што се состои од комора AttofluorTM која содржи покривка обложена со златни наночестички. в Внимателно погледнете го примерокот (да не се мери). d го претставува униформниот профил на ласерскиот зрак и (д) симулираната последователна распределба на температурата на рамнината на примерокот на златните наночестички. f е прстенест профил на ласерски зрак погоден за генерирање рамномерна температура како што е прикажано во симулацијата на добиената дистрибуција на температурата прикажана во (g). Лента за скала: 30 µm.
Конкретно, неодамна постигнавме загревање на клетките на цицачите со LA-HTM и CGM и ги следевме реакциите на клеточниот топлински шок во опсег од 37-42°C, демонстрирајќи ја применливоста на оваа техника за сликање на една жива клетка. Сепак, примената на LA-HTM за проучување на микроорганизми на високи температури не е недвосмислена, бидејќи бара поголема претпазливост во споредба со клетките на цицачите: прво, загревањето на дното на медиумот за десетици степени (наместо неколку степени) води до силен вертикален температурен градиент. може да создаде конвекција на течност 44 која, доколку не е цврсто прицврстена на подлогата, може да предизвика непожелно движење и мешање на бактериите. Оваа конвекција може да се елиминира со намалување на дебелината на течниот слој. За таа цел, во сите експерименти претставени подолу, бактериски суспензии беа поставени помеѓу две покривки со дебелина приближно 15 µm поставени во метална чаша (AttofluorTM, Thermofisher, Сл. 1б, в). Во принцип, конвекцијата може да се избегне ако дебелината на течноста е помала од големината на зракот на грејниот ласер. Второ, работата во таква ограничена геометрија може да ги задуши аеробните организми (види Сл. S2). Овој проблем може да се избегне со користење на подлога што е пропустлива за кислород (или кој било друг витален гас), со оставање заробени воздушни меури во внатрешноста на капакот или со дупчење дупки на горната покривка (види Сл. S1) 45 . Во оваа студија, го избравме последното решение (слики 1б и S1). Конечно, ласерското греење не обезбедува рамномерна распределба на температурата. Дури и при ист интензитет на ласерскиот зрак (сл. 1г), распределбата на температурата не е рамномерна, туку наликува на Гаусовата дистрибуција поради топлинска дифузија (сл. 1д). Кога целта е да се воспостават прецизни температури во видното поле за проучување на биолошките системи, нерамните профили не се идеални и исто така може да доведат до термофоретско движење на бактериите доколку не се прилепуваат на подлогата (види Сл. S3, S4)39. За таа цел, користевме просторен модулатор на светлина (SLM) за да го обликуваме инфрацрвениот ласерски зрак според обликот на прстенот (сл. 1f) во рамнината на примерокот за да постигнеме совршено рамномерна распределба на температурата во дадена геометриска област. и покрај термичката дифузија (сл. 1г) 39, 42, 46. Ставете го горниот капак над метален сад (слика 1б) за да избегнете испарување на медиумот и набљудувајте барем неколку дена. Бидејќи оваа горна покривка не е запечатена, дополнителен медиум може лесно да се додаде во секое време доколку е потребно.
За да илустрираме како функционира LA-HTM и да ја покажеме неговата применливост во термофилните истражувања, ги проучувавме аеробните бактерии Geobacillus stearothermophilus, кои имаат оптимална температура на раст од околу 60-65°C. Бактеријата има и флагели и способност за пливање, што дава уште еден показател за нормална клеточна активност.
Примероците (сл. 1б) беа претходно инкубирани на 60°C за еден час и потоа беа ставени во држач за примероци LA-HTM. Оваа претинкубација е опционална, но сепак корисна, поради две причини: Прво, кога ласерот е вклучен, тој предизвикува клетките веднаш да растат и делат (видете го филмот М1 во Дополнителни материјали). Без претходна инкубација, бактерискиот раст обично се одложува за околу 40 минути секој пат кога се загрева нова област за гледање на примерокот. Второ, 1 час пред инкубацијата промовираше адхезија на бактериите на покривката, спречувајќи ги клетките да се оддалечат од видното поле поради термофореза кога ласерот беше вклучен (види филм М2 во Дополнителни материјали). Термофорезата е движење на честички или молекули по температурен градиент, обично од топло кон студено, а бактериите не се исклучок43,47. Овој непожелен ефект се елиминира во дадена област со користење на SLM за обликување на ласерскиот зрак и постигнување рамна распределба на температурата.
На сл. Слика 2 ја прикажува температурната распределба измерена со CGM добиена со зрачење на стаклена подлога обложена со златни наночестички со прстенест ласерски зрак (сл. 1f). Беше забележана рамна температурна дистрибуција на целата површина покриена со ласерскиот зрак. Оваа зона беше поставена на 65°C, оптимална температура за раст. Надвор од овој регион, температурната крива природно паѓа на \(1/r\) (каде \(r\) е радијалната координата).
Температурна карта на мерењата на CGM добиена со користење на прстенест ласерски зрак за зрачење на слој од златни наночестички за да се добие рамен температурен профил на кружна површина. б Изотерма на температурната карта (а). Контурата на ласерскиот зрак е претставена со сив круг со точки. Експериментот беше повторен двапати (види Дополнителни материјали, слика S4).
Одржливоста на бактериските клетки беше следена неколку часа користејќи LA-HTM. На сл. 3 го прикажува временскиот интервал за четири слики направени од филм од 3 часа и 20 минути (Филм М3, Дополнителни информации). Беше забележано дека бактериите активно се размножуваат во кружната област дефинирана со ласерот каде што температурата беше оптимална, приближувајќи се до 65°C. Спротивно на тоа, растот на клетките беше значително намален кога температурата падна под 50 ° C за 10 секунди.
Слики со оптичка длабочина на бактериите G. stearothermophilus кои растат по ласерско загревање во различни периоди, (а) t = 0 мин, (б) 1 час 10 мин, (в) 2 ч. 20 мин, (г) 3 ч. 20 мин, надвор од 200 Извлечено од едноминутен филм (М3 филм даден во Дополнителни информации) поставен на соодветната температурна карта. Ласерот се вклучува во моментот \(t=0\). На сликата со интензитет се додадени изотерми.
За понатамошно квантифицирање на растот на клетките и неговата зависност од температурата, го измеривме зголемувањето на биомасата на различни колонии на првично изолирани бактерии во видното поле на Movie M3 (сл. 4). Матичните бактерии избрани на почетокот на формирањето на единицата за формирање на мини колонии (mCFU) се прикажани на Слика S6. Мерењата на сувата маса беа направени со камера CGM 48 која се користеше за мапирање на распределбата на температурата. Способноста на CGM да мери сува тежина и температура е јачината на LA-HTM. Како што се очекуваше, високата температура предизвика побрз раст на бактериите (сл. 4а). Како што е прикажано на полу-логовиот график на Сл. 4б, растот на сите температури го следи експоненцијалниот раст, каде што податоците ја користат експоненцијалната функција \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), каде \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – време на генерирање (или време на удвојување), \( g =1/ \tau\) – стапка на раст (број на поделби по единица време ). На сл. 4c ја покажува соодветната стапка на раст и времето на создавање како функција од температурата. Брзо растечките mCFU се карактеризираат со заситеност на растот по два часа, очекувано однесување поради високата бактериска густина (слично на стационарната фаза во класичните течни култури). Општата форма \(g\left(T\десно)) (сл. 4c) одговара на очекуваната двофазна крива за G. stearothermophilus со оптимална стапка на раст околу 60-65°C. Споредете ги податоците користејќи кардинален модел (слика S5)49 каде \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\десно)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, што добро се согласува со другите вредности наведени во литературата49. Иако параметрите зависни од температурата се репродуцираат, максималната стапка на раст на \({G}_{0}\) може да варира од еден до друг експеримент (видете ги сликите S7-S9 и филмот M4). За разлика од параметрите за прилагодување на температурата, кои треба да бидат универзални, максималната стапка на раст зависи од својствата на медиумот (достапност на хранливи материи, концентрација на кислород) во рамките на набљудуваната геометрија на микроскала.
Микробен раст на различни температури. mCFU: Минијатурни единици за формирање колонија. Податоци добиени од видео на една бактерија која расте во температурен градиент (филм М3). б Исто како (а), полулогаритамска скала. c Стапка на раст\(\tau\) и време на создавање\(g\) пресметано од линеарна регресија (б). Хоризонтални ленти за грешки: температурен опсег преку кој mCFU се проширија во видното поле за време на растот. Вертикални ленти за грешка: стандардна грешка на линеарна регресија.
Покрај нормалниот раст, некои бактерии понекогаш испливаа во поглед за време на ласерското загревање, што е очекувано однесување за бактериите со флагели. Филмот М5 во дополнителни информации прикажува вакви пливачки активности. Во овој експеримент, еднообразно ласерско зрачење беше искористено за да се создаде температурен градиент, како што е прикажано на сликите 1d, e и S3. Слика 5 покажува две секвенци на слики избрани од филмот М5 кои покажуваат дека една бактерија покажува насочено движење додека сите други бактерии остануваат неподвижни.
Двете временски рамки (а) и (б) покажуваат пливање на две различни бактерии означени со точки кругови. Сликите се извадени од филмот М5 (обезбеден како дополнителен материјал).
Во случајот со G. stearothermophilus, активното движење на бактериите (сл. 5) започна неколку секунди по вклучувањето на ласерскиот зрак. Оваа опсервација го нагласува временскиот одговор на овој термофилен микроорганизам на зголемување на температурата, како што веќе беше забележано од Мора и сор. 24 . Темата за бактериска подвижност, па дури и термотакса може дополнително да се истражи со користење на LA-HTM.
Микробиското пливање не треба да се меша со другите видови физичко движење, имено (i) Брауново движење, кое се чини дека е хаотично движење без дефинитивна насока, (ii) конвекција 50 и термофореза 43, што се состои во редовно движење на движење долж температурата градиент.
G. stearothermophilus е познат по својата способност да произведува високо отпорни спори (формирање спори) кога е изложен на неповолни еколошки услови како одбрана. Кога условите на околината повторно стануваат поволни, спорите ртат, формирајќи живи клетки и продолжувајќи го растот. Иако овој процес на спорулација/ртење е добро познат, тој никогаш не бил забележан во реално време. Користејќи го LA-HTM, овде го известуваме првото набљудување на настаните на 'ртење кај G. stearothermophilus.
На сл. 6а прикажува слики со временско застарување на оптичка длабочина (OT) добиени со користење на CGM сет од 13 спори. За целото време на собирање (15 ч. 6 мин., \(t=0\) – почеток на ласерското загревање), никнале 4 од 13 спори, во последователни временски точки \(t=2\) ч, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' и \(11\) h \(30\)'. Иако само еден од овие настани е прикажан на Слика 6, 4 настани на 'ртење може да се забележат во филмот M6 во дополнителниот материјал. Интересно, се чини дека ртењето е случајно: не ртат сите спори и не ртат во исто време, и покрај истите промени во условите на животната средина.
тајм-лапс кој се состои од 8 OT слики (потопување во масло, 60x, 1,25 NA цел) и (б) еволуција на биомаса на агрегатите на G. stearothermophilus. в (б) Нацртано на полу-дневна скала за да се нагласи линеарноста на стапката на раст (испрекината линија).
На сл. 6b,c ја прикажува биомасата на клеточните популации во видното поле како функција од времето во текот на целиот период на собирање податоци. Брзото распаѓање на сувата маса забележано на \(t=5\)h на сл. 6б, в, поради излезот на некои ќелии од видното поле. Стапката на раст на овие четири настани е \(0,77\pm 0,1\) h-1. Оваа вредност е повисока од стапката на раст поврзана со Слика 3. 3 и 4, каде клетките растат нормално. Причината за зголемената стапка на раст на G. stearothermophilus од спорите е нејасна, но овие мерења го истакнуваат интересот на LA-HTM и работат на ниво на една клетка (или на ниво на единечна mCFU) за да дознаат повеќе за динамиката на клеточниот живот .
За дополнително да ја покажеме разновидноста на LA-HTM и неговите перформанси на високи температури, го испитавме растот на Sulfolobus shibatae, хипертермофилна ацидофилна археа со оптимална температура на раст од 80°C51. Во споредба со G. stearothermophilus, овие археи, исто така, имаат многу различна морфологија, наликувајќи на сфери од 1 микрон (коки) наместо издолжени прачки (бацили).
Слика 7а се состои од секвенцијални слики со оптичка длабочина на S. shibatae mCFU добиени со помош на CGM (видете M7 игран филм во Дополнителни материјали). Овој mCFU расте на околу 73°C, под оптималната температура од 80°C, но во температурниот опсег за активен раст. Набљудивме повеќе настани на фисија што направија mCFU да изгледаат како микрогрозје од археи по неколку часа. Од овие OT слики, mCFU биомасата беше мерена со текот на времето и претставена на Слика 7б. Интересно, S. shibatae mCFUs покажаа линеарен раст наместо експоненцијален раст забележан со G. stearothermophilus mCFUs. Имаше долготрајна дискусија 52 за природата на стапките на раст на клетките: додека некои студии известуваат за стапки на раст на микробите кои се пропорционални со нивната големина (експоненцијален раст), други покажуваат константна стапка (линеарен или биланеарен раст). Како што е објаснето од Tzur et al.53, за разлика помеѓу експоненцијален и (би)линеарен раст бара прецизност од <6% во мерењата на биомасата, што е недостапно за повеќето QPM техники, дури и со интерферометрија. Како што е објаснето од Tzur et al.53, за разлика помеѓу експоненцијален и (би)линеарен раст бара прецизност од <6% во мерењата на биомасата, што е недостапно за повеќето QPM техники, дури и со интерферометрија. Како объяснили Цур и др.53, различноста на експоненциального и (би)линейного роста бара точности <6% во измерениях биомассы, што е недостижно за повеќешинести методов QPM, даже со искористување на интерферометриите. Како што е објаснето од Zur et al.53, за разлика помеѓу експоненцијален и (би)линеарен раст бара <6% точност во мерењата на биомасата, што е недостижно за повеќето QPM методи, дури и со користење на интерферометрија.Како што е објаснето од Зур и сор. 53, за разлика помеѓу експоненцијален и (би)линеарен раст бара помалку од 6% точност во мерењата на биомасата, што е недостижно за повеќето QPM методи, дури и кога се користи интерферометрија. CGM ја постигнува оваа точност со прецизност под-pg при мерењата на биомасата36,48.
Time-lapse кој се состои од 6 OT слики (потопување во масло, 60x, NA цел 1.25) и (б) микро-CFU еволуција на биомаса мерена со CGM. Погледнете го филмот М7 за повеќе информации.
Совршено линеарниот раст на S. shibatae беше неочекуван и сè уште не е пријавен. Сепак, се очекува експоненцијален раст, барем затоа што со текот на времето, мора да се појават повеќекратни поделби на 2, 4, 8, 16 ... клетки. Претпоставивме дека линеарниот раст може да се должи на клеточна инхибиција поради густо пакување на клетките, исто како што растот на клетките се забавува и на крајот достигнува состојба на мирување кога густината на клетките е превисока.
Заклучуваме со дискусија за следните пет точки на интерес за возврат: намалување на волуменот на загревање, намалување на топлинската инерција, интерес за златни наночестички, интерес за квантитативна фазна микроскопија и можен температурен опсег во кој може да се користи LA-HTM.
Во споредба со отпорното греење, ласерското греење што се користи за развој на HTM нуди неколку предности, кои ги илустрираме во оваа студија. Особено, во течни медиуми во видното поле на микроскопот, волуменот на загревање се одржува во рамките на неколку (10 μm) 3 волумени. На овој начин, активни се само набљудуваните микроби, додека другите бактерии мируваат и можат да се користат за понатамошно проучување на примерокот - нема потреба да се менува примерокот секогаш кога треба да се провери нова температура. Дополнително, греењето во микроскала овозможува директно испитување на голем опсег на температури: Слика 4в е добиена од 3-часовен филм (Филм М3), кој обично бара подготовка и испитување на неколку примероци - по еден за секој од примероците што се испитуваат. y е температурата што го претставува бројот на денови во експериментот. Намалувањето на загреаниот волумен, исто така, ги одржува сите околни оптички компоненти на микроскопот, особено објективната леќа, на собна температура, што досега беше голем проблем со кој се соочува заедницата. LA-HTM може да се користи со кој било објектив, вклучувајќи ги и леќите за потопување во масло, и ќе остане на собна температура дури и при екстремни температури во видното поле. Главното ограничување на методот на ласерско загревање што го известуваме во оваа студија е дека ќелиите што не се лепат или лебдат може да бидат далеку од видното поле и тешко се проучуваат. Решението може да биде користење леќи со мало зголемување за да се постигне поголем пораст на температурата над неколку стотици микрони. Оваа претпазливост е придружена со намалување на просторната резолуција, но ако целта е да се проучува движењето на микроорганизмите, не е потребна висока просторна резолуција.
Временската скала за греење (и ладење) на системот \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}) зависи од неговата големина , според законот \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), каде \ (L\ ) е карактеристичната големина на изворот на топлина (дијаметарот на ласерскиот зрак во нашата студија е \(L\ околу 100\) μm), \(D\) е топлинска дифузија на околината (просек во нашата случај, стакло и вода Брзина на дифузија\(D\ околу 2\ пати {10}^{-7}\) m2/s Затоа, во оваа студија, временските одговори од редот на 50 ms, т.е. може да се очекуваат температурни промени Ова моментално воспоставување на пораст на температурата не само што го скратува времетраењето на експериментот, туку овозможува и прецизно тајмирање \(t=0\) за секое динамично проучување на температурните ефекти.
Нашиот предложен метод е применлив за секоја супстрат што апсорбира светлина (на пример, комерцијални примероци со ITO слој). Сепак, златните наночестички се способни да обезбедат висока апсорпција во инфрацрвениот и ниска апсорпција во видливиот опсег, чии последни карактеристики се од интерес за ефективно оптичко набљудување во видливиот опсег, особено кога се користи флуоресценција. Покрај тоа, златото е биокомпатибилно, хемиски инертно, оптичката густина може да се прилагоди од 530 nm до блиску до инфрацрвеното светло, а подготовката на примерокот е едноставна и економична29.
Микроскопијата на брановиот фронт со попречна решетка (CGM) овозможува не само мапирање на температурата во микроскала, туку и следење на биомасата, што го прави особено корисен (ако не е потребно) во комбинација со LA-HTM. Во текот на изминатата деценија, развиени се и други техники за температурна микроскопија, особено во областа на биографирањето, и повеќето од нив бараат употреба на флуоресцентни сонди чувствителни на температура54,55. Сепак, овие методи беа критикувани, а некои извештаи измерија нереални температурни промени во клетките, веројатно поради фактот што флуоресценцијата зависи од многу други фактори освен температурата. Покрај тоа, повеќето флуоресцентни сонди се нестабилни на високи температури. Затоа, QPM и особено CGM претставуваат идеална техника за температурна микроскопија за проучување на животот на високи температури користејќи оптичка микроскопија.
Студиите на S. shibatae, кои живеат оптимално на 80°C, покажуваат дека LA-HTM може да се примени за проучување на хипертермофили, а не само за едноставни термофили. Во принцип, не постои ограничување за опсегот на температури што може да се постигне со помош на LA-HTM, па дури и температури над 100°C може да се постигнат при атмосферски притисок без вриење, како што е прикажано од нашата група од 38 во апликациите за хидротермална хемија на атмосферски притисок A. Ласер се користи за загревање на златни наночестички 40 на ист начин. Така, LA-HTM има потенцијал да се користи за набљудување на невидени хипертермофили со стандардна оптичка микроскопија со висока резолуција под стандардни услови (т.е. под стрес на околината).
Сите експерименти беа изведени со помош на домашен микроскоп, вклучувајќи и Köhler осветлување (со LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), држач за примерок со рачно xy движење, цели (Olympus, 60x, 0.7 NA, воздух, LUCPlanFLN60X или 60x, ONA1. , UPLFLN60XOI), CGM камера (QLSI вкрстена решетка, чекор од 39 µm, 0,87 mm од сензорот на камерата Andor Zyla) за да се обезбеди интензитет и сликање на брановидни предни страни и sCMOS камера (ORCA Flash 4.0 V3, 16-битен режим , од Hamamatsu) за снимање на податоци прикажани на слика 5 (бактериско пливање). Дихроичен разделувач на зрак е 749 nm BrightLine раб (Semrock, FF749-SDi01). Филтерот на предната страна на фотоапаратот е филтер за краток пропус 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Ласер од титаниум сафир (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, пумпана цунами ласерска празнина, Spectra-Physics на Сл. 2-5, дополнително заменет со Millenia ласер, Spectraphysics 10 W, пумпана Мира ласерска празнина, Кохерентна, Сл.2 за. -5). 6 и 7) се поставени на брановата должина \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, што одговара на плазмонскиот резонантен спектар на златни наночестички. Просторни светлосни модулатори (1920 × 1152 пиксели) беа купени од Meadowlark Optics.
Брановата микроскопија со вкрстена решетка (CGM) е техника на оптичка микроскопија базирана на комбинирање на дводимензионална дифракциона решетка (исто така позната како вкрстена решетка) на растојание од еден милиметар од сензорот на конвенционалната камера. Најчестиот пример на CGM што го користевме во оваа студија се нарекува интерферометар со попречно поместување со четири бранови должини (QLSI), каде што вкрстената решетка се состои од шема на шаховска табла за интензитет/фаза воведена и патентирана од Примот и сор. во 200034. Вертикалните и хоризонталните линии на решетка создаваат сенки слични на мрежа на сензорот, чиешто изобличување може нумерички да се обработи во реално време за да се добие оптичкото изобличување на брановиот фронт (или еквивалентен фазен профил) на упадната светлина. Кога се користи на микроскоп, CGM камерата може да ја прикаже разликата во оптичката патека на снимениот објект, позната и како оптичка длабочина (OT), со чувствителност од редот на нанометри36. При секое мерење CGM, со цел да се елиминираат сите дефекти во оптичките компоненти или зраците, мора да се земе примарна референтна OT слика и да се одземе од сите последователни слики.
Температурната микроскопија беше изведена со помош на CGM камера како што е опишано во референцата. 32. Накратко, загревањето на течноста го менува нејзиниот индекс на рефракција, создавајќи ефект на термичка леќа што го искривува упадниот зрак. Ова нарушување на брановиот фронт се мери со CGM и се обработува со помош на алгоритам за деконволуција за да се добие тродимензионална температурна дистрибуција во течниот медиум. Ако златните наночестички се рамномерно распоредени низ примерокот, мапирањето на температурата може да се направи во области без бактерии за да се добијат подобри слики, што понекогаш го правиме. Референтната CGM слика беше добиена без загревање (со исклучен ласер) и последователно снимена на истата локација на сликата со вклучен ласер.
Мерењето на сува маса се постигнува со користење на истата CGM камера што се користи за снимање на температурата. Референтните слики на CGM беа добиени со брзо поместување на примерокот во x и y за време на изложеноста како средство за просечно одредување на каква било нехомогеност во ОТ поради присуството на бактерии. Од OT сликите на бактериите, нивната биомаса е добиена со користење на ансамбл од слики на области избрани со користење на алгоритам за сегментација на Matlab (види потсекција „Нумерички код“), следејќи ја постапката опишана во реф. 48. Накратко, ја користиме релацијата \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), каде \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\десно)\) е сликата со оптичка длабочина, \(m\) е сувата тежина и \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) е константа. Избравме \({{{\rm{\алфа))))))=0,18\) µm3/pg, што е типична константа за живите клетки.
Покривка со дијаметар од 25 mm и дебелина од 150 µm, обложена со златни наночестички беше ставена во комората AttofluorTM (Thermofisher) со златните наночестички свртени нагоре. Geobacillus stearothermophilus беше прекултуриран преку ноќ во LB медиум (200 вртежи во минута, 60°C) пред секој ден од експериментите. Капка од 5 µl од суспензијата на G. stearothermophilus со оптичка густина (OD) од 0,3 до 0,5 беше ставена на капак со златни наночестички. Потоа, на капката беше фрлена тркалезна покривка со дијаметар 18 mm со дупка со дијаметар од 5 mm во центарот, а 5 μl бактериска суспензија со иста оптичка густина постојано се нанесуваше на центарот на дупката. Бунарите на покривките се подготвени во согласност со постапката опишана во ref. 45 (видете Дополнителни информации за повеќе информации). Потоа додадете 1 ml LB медиум на покривката за да спречите сушење на течниот слој. Последната покривка е поставена над затворениот капак на комората Attofluor™ за да се спречи испарување на медиумот за време на инкубацијата. За експерименти со ртење, користевме спори, кои, по конвенционалните експерименти, понекогаш го покриваа горниот капак. Сличен метод е користен за добивање на Sulfolobus shibatae. Три дена (200 вртежи во минута, 75°C) прелиминарно одгледување на Thiobacillus serrata беа спроведени во средина 182 (DSMZ).
Примероците од златни наночестички беа подготвени со мицеларна блок кополимерна литографија. Овој процес е детално опишан во Поглавје. 60. Накратко, мицели кои инкапсулираат златни јони беа синтетизирани со мешање на кополимерот со HAuCl4 во толуен. Исчистените покривки потоа беа потопени во растворот и третирани со УВ зрачење во присуство на средство за намалување за да се добијат златни семиња. Конечно, златните семиња беа одгледувани со контактирање на капакот со воден раствор од KAuCl4 и етаноламин за 16 минути, што резултираше со квази-периодичен и многу униформен распоред на не-сферични златни наночестички во блиската инфрацрвена светлина.
За да ги претвориме интерферограмите во OT слики, користевме домашен алгоритам, како што е наведено во врската. 33 и е достапен како Matlab пакет во следното јавно складиште: https://github.com/baffou/CGMprocess. Пакетот може да пресметува интензитет и OT слики врз основа на снимени интерферограми (вклучувајќи референтни слики) и растојанија на низата на камерата.
За да се пресмета фазната шема применета на SLM за да се добие даден температурен профил, користевме претходно развиен домашен алгоритам39,42 кој е достапен во следното јавно складиште: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Влезот е саканото температурно поле, кое може да се постави дигитално или преку монохроматска bmp слика.
За да ги сегментираме клетките и да ја измериме нивната сува тежина, го користевме нашиот Matlab алгоритам објавен во следното јавно складиште: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. На секоја слика, корисникот мора да кликне на бактериите или mCFU од интерес, да ја прилагоди чувствителноста на стапчето и да го потврди изборот.
За повеќе информации за дизајнот на студијата, видете го апстрактот на извештајот за истражување на природата поврзан со овој напис.
Податоците кои ги поддржуваат резултатите од оваа студија се достапни од соодветните автори на разумно барање.
Изворниот код што се користи во оваа студија е детален во делот Методи, а верзиите за отстранување грешки може да се преземат од https://github.com/baffou/ во следните складишта: SLM_temperatureShaping, CGMprocess и CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Увид во термофилите и нивните апликации со широк спектар. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Увид во термофилите и нивните апликации со широк спектар.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. and Sharma, AK Преглед на термофилите и нивната широка примена. Мехта, Р., Сингал, П., Синг, Х., Дамле, Д. и Шарма, АК 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта, Р., Сингал, П., Синг, Х., Дамле, Д. и Шарма, АК.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. и Sharma AK Длабоко разбирање на термофилите и широк спектар на апликации.3 Биотехнологија 6, 81 (2016).
Време на објавување: 26-ти септември 2022 година